中科院遺傳發育所建立多亞基SCF E3連線酶的體外重組系統

蛋白質合成與降解間的平衡，對於維持細胞內穩態及機體的正常功能具有重要作用。泛素

-

蛋白酶體途徑是真核細胞中蛋白降解的主要途徑之一，目標蛋白的泛素化修飾由泛素活化酶

（E1）

、泛素結合酶

（E2）

和泛素連線酶

（E3）

協同完成。

SCF （SKP1/Cullin1/F-box）E3

連線酶是一類多亞基

RING E3

連線酶，由

SKP1

蛋白、

Cullin1

蛋白、

RBX1

蛋白和可變的

F-box

蛋白組成，廣泛存在於真核生物中，在生長髮育和脅迫應答中發揮重要作用。

建立體外泛素化修飾檢測系統，對於探索

E3

泛素連線酶和底物蛋白的特異識別關係及其在生長髮育中的分子機理頗為重要。然而，由於多亞基

SCF E3

泛素連線酶的組成比較複雜，獲得具有活性的

E3

複合體組分並鑑定與其特異協同工作的

E2

存在較大困難，植物來源的多亞基

SCF E3

泛素連線酶的體外活性重組體系尚未建立。

中國科學院遺傳與發育生物學研究所李家洋研究組長期從事植物激素獨腳金內酯相關分子機理研究。前期研究發現，在獨腳金內酯訊號通路中，獨腳金內酯促進其受體蛋白

D14

與

F-box

蛋白

D3

以及底物蛋白

D53

互作，

SCF

D3

E3

連線酶進而對

D53

蛋白進行泛素化修飾和降解，

解除

D53

蛋白對下游基因轉錄的抑制作用（

Jiang et al。，

Nature

， 2013；Wang et al。，

Nature，

2020

）。其中，

D53

蛋白的泛素化是

獨腳金內酯

訊號轉導的關鍵事件。

6

月

24

日，李家洋研究組在

Molecular Plant

上，

線上發表了題為

An engineered platform for reconstituting functional multisubunit SCF E3 ligase in vitro

的研究論文

。該研究以水稻的

SCF

D3

E3

連線酶為出發點，透過質譜鑑定了

SCF

D3

E3

複合體組分並在原核、真核系統中進行了表達純化，進一步篩選了能與

SCF

D3

E3

連線酶協同工作的

E2

，並在體外重組了有活性的

SCF

D3

E3

連線酶。為提高重組效率，研究團隊設計了串聯融合蛋白

SKP1-Cullin1-RBX1（eSCR）

，並利用

eSCR

融合蛋白在體外重組了有活性的

eSCF

D3

E3

連線酶。

SCF

D3

E3

和

eSCF

D3

E3

連線酶均能在體外催化底物蛋白

D53

的泛素化修飾，加入受體蛋白

D14

和獨腳金內酯人工合成類似物

rac

-GR24

能夠進一步增強

D53

蛋白的泛素化水平，與內源獨腳金內酯訊號傳導相一致，說明利用該體外系統能夠反映內源獨腳金內酯訊號轉導的狀態，為剖析不同植物中獨腳金內酯訊號轉導途徑提供了新的技術體系。

該研究進一步以

eSCR

為骨架蛋白，與水稻赤黴素訊號途徑的

F-box

蛋白

GID2

重組，獲得了有活性的

eSCF

GID2

E3

泛素連線酶；與調控人類腫瘤發生的關鍵

F-box

蛋白

CDC4

和調控人類細胞分裂過程的關鍵

F-box

蛋白

Fbxl18

分別進行體外重組，獲得有活性的

eSCF

CDC4

E3

和

eSCF

Fbx118

E3

泛素連線酶，其中

eSCF

CDC4

E3

能夠在體外對其底物蛋白

HsSic1

進行泛素化修飾。該技術在真核生物

多亞基

SCF E3

泛素連線酶研究中頗具應用前景。

上述成果為解析多亞基

SCF E3

泛素連線酶與其底物蛋白的特異性識別關係提供了可靠的系統，併為探究激素訊號轉導機制、鑑定癌症治療靶標及其他生物學過程提供了重要平臺。

多亞基

SCF E3

泛素連線酶體外活性重組方法技術平臺展示。

A、

利用表達純化的

SKP1

、

Cullin1

、

RBX1

、

D3

、

OsUb

、

OsE1

和

OsE2（OsUBC14）

，在體外重組有活性的

SCF

D3

E3

泛素連線酶；

B、

利用

SKP1-Cullin1-RBX1（eSCR）

融合蛋白，在體外重組有活性的

eSCF

D3

E3

泛素連線酶；

C、eSCR

融合蛋白能夠與不同的

F-box

重組出多種

eSCF E3

，在體外實現底物蛋白的泛素化修飾。紅色方塊代表

NEDD8

修飾。