蛋白質測序常見問題彙總（二）

上期給大家彙總了一些有關蛋白質測序原理的基礎知識，這期著重給大家列舉一些蛋白質測序實驗中新手可能想問的問題，希望對網接觸蛋白質測序的實驗新手在選擇蛋白質測序方法上有指導性幫助。

1. 蛋白質樣品純度較高，有什麼快速的蛋白質測序的方法嗎？

可以透過鑑定蛋白質的肽譜圖（Peptide mass fingerprinting，PMF）達到快速測定蛋白質測序的目的。因為每個蛋白質的序列是特異的，經過特定酶切產生的多肽的質量也是一定的，因此，可以利用這一特性，透過測定蛋白質酶切後產生的多肽的質量圖譜，即測定蛋白質肽譜圖，再與資料庫蛋白質酶切的理論肽譜圖進行比對，從而推斷出蛋白質的序列。

2. 蛋白質肽譜圖鑑定是基於哪項質譜技術？

測定肽混合物質量數有效的質譜儀是MALDI-TOF-MS（基質輔助鐳射解吸電離飛行時間質譜，英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry），靈敏度高，譜峰簡單，每個譜峰代表一種肽段。MALDI-TOF-MS分析肽混合物時，能耐受適量的緩衝劑、鹽，而且各個肽片幾乎都只產生單電荷離子，因此MALDI-TOF成為進行分析PMF的首選方法。

3. 肽譜圖鑑定的優缺點？

透過測定蛋白質肽譜圖分析蛋白質序列的方法的優勢在於此項技術只用經過以及質譜分析來對蛋白質進行分析，測定的速度較快，而且因為蛋白質序列的特異性，肽譜圖法可以推斷出可信度較高的蛋白質，也較為精準。但是由於肽譜圖測定需要依賴資料庫資訊比對，因此，對於資料庫不包含的蛋白質，肽譜圖不能夠進行準確分析。

4. 準確度高的蛋白質測序法有哪些？

雖然理論上蛋白質酶切產生的肽段圖譜是特定的，但是影響蛋白質酶切，以及鑑定肽段質量的因素眾多，因此，肽譜圖對蛋白質測序來說還是一種比較粗略的測定方法，更為精準的蛋白質測定方法包括Edman降解測序法，串聯質譜測序法等。

5. 如果蛋白樣品中含有多個蛋白質，有什麼方法可以一次性對所有蛋白質進行測序的嗎？

MS/MS質譜鑑定可以檢測一個蛋白條帶中的多個蛋白質，只需要將蛋白膠切下來送測序即可，在這個過程中保證切膠使用的刀具是乾淨無汙染的，同時避免切下旁邊的雜蛋白。質譜鑑定公司會對膠樣中的蛋白質進行酶切，再測定肽段序列，然後將肽段序列與已知蛋白資料庫進行比對，即可獲知膠樣中蛋白質的ID，並推測出蛋白的序列。

6. Edman降解法能夠對所有蛋白質進行測序？

Edman降解測序法的優勢是能夠對未知的蛋白質進行測序，目前這項技術已經近乎完善，但是Edman也有一定的侷限性。例如，Edman講解法測序不能夠解決蛋白質N端環化、封閉的測序問題，另外被修飾的蛋白質不能給出確切的訊號，這些都在一定程度上限制了Edman降解法的廣泛應用。

7. 對未知的蛋白質來說，如果蛋白質的N端有環化封閉現象，或者N端有未知修飾時，如何對蛋白質序列進行準確分析呢？

對於序列未知的蛋白質，特別是經過改造後的重組蛋白質，體外合成蛋白質，以及改造的抗體，或者基因序列未被研究過的蛋白質，這類蛋白質的資訊往往不包含在蛋白質資料庫中。要實現對這類蛋白質序列的準確分析就必須透過蛋白質從頭測序的方法。蛋白質從頭測序法是一項基於質譜技術的分析方法。與傳統質譜鑑定的方法類似，從頭測序法也是先將蛋白質酶切成小的多肽片段，接著經由高效液相色譜對多肽片段進行分離，再依次透過兩級質譜對多肽片段序列進行測定。相較於傳統質譜測序，從頭測序經過精密的演算法，保證鑑定的多肽序列，能夠高準確度推導的蛋白質序列，並且能夠不依賴於資料庫比對，實現蛋白質序列從頭測定。

8. 如何對蛋白質測序結果進行驗證？

如果一個蛋白質的序列被成功鑑定了，那麼Western blot是很好的驗證方法。由於Western blot方法的特異性和靈敏度，因此，透過Western blot驗證的蛋白質幾乎可以100%確定蛋白質鑑定的準確性，排出質譜鑑定的假陽性。可以選取針對蛋白質上面某一段序列製備的單克隆抗體進行檢測，再將Western blot的結果與鑑定的蛋白序預計分子量進行比對，即可確定蛋白質測序結果的準確性。

9. 已知蛋白質序列，如何對蛋白質結構進行預測？

蛋白質結構預測，即從蛋白質一級結構預測它的摺疊和二級，三級和四級的蛋白質結構。目前有兩種常用的蛋白質結構預測的方法：1。 同源建模法，透過已知同源或同一家族中蛋白質的結構，再對目標蛋白質結構進行推測；2。 摺疊識別法，透過總結已知的蛋白質摺疊法作為目標蛋白質摺疊的模板，再根據資料庫推測出匹配的目的蛋白質摺疊的過程。

講了這麼多實驗新手可能會關心的有關蛋白質測序的問題，但是大家實際遇到的問題各有不同，我們在這裡就挑選一下具體問題進行回答

1. Edman降解測序是否可以測定含有大概130多個氨基酸的未知蛋白？

130個氨基酸序列比較長，已經超出了蛋白質Edman測序的限度，建議使用蛋白從頭測序（de novo sequencing）對蛋白質序列進行測定。蛋白質從頭測序不需要藉助任何蛋白質資料庫，可以對任何蛋白質，包括突變、經過生物改造的非天然蛋白質等進行測序。

2. 實驗中透過Western blot鑑定出一種目的蛋白，分子量約29KD，想直接跑單向SDS-PAGE,然後切膠進行PMF，是否可行？PMF和Edman降解法那種更好？

使用SDS-PAGE分離，再將蛋白膠切下來做PMF是完全可行的。但是PMF比對的是肽譜圖，存在一定的假陽性機率，因此對蛋白純度的要求較高。所以，建議SDS膠跑開一些，保證切下來的蛋白膠不被其他蛋白膠影響，另外，切膠的時候注意不能被角蛋白等雜蛋白汙染。PMF鑑定效率都比N端測序要更高，價格也更低。但是蛋白量、蛋白純度足夠高的話，PMF的結果也是同樣可信的。