組蛋白翻譯後修飾及研究方法介紹

1

組蛋白修飾基礎知識介紹

//

真核生物中染色質的基本結構單位是核小體，其由組蛋白八聚體和纏繞在外的DNA組成。每個核小體又是由兩個亞基構成的，而每個亞基包括H2A、H2B、H3和H4這四個組蛋白。組蛋白尾部的蛋白結構域帶正電荷，與帶負電荷的DNA相結合。其最N末端部分不參與核小體組裝，而是從核心結構中突出（圖1）［1］，更適合與相鄰環境進行相互作用，因此易受翻譯後修飾（PTM）的影響。在四種不同的組蛋白質中，組蛋白H3和H4的尾部比H2A和H2B更容易發生PTM［2］。

圖1 核小體的結構

//

常見的組蛋白PTM包括甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化等（圖2）

。這些修飾方式可以多種組合形式出現，發揮不同的生物學功能。組蛋白髮生修飾後會使染色質的構象等發生變化，從而影響了DNA與組蛋白之間的相互作用，進而調控基因的轉錄表達。可以說，組蛋白翻譯後修飾與DNA甲基化是基因和表觀調控的基本手段，也是細胞和發育過程的基礎［2］。下面以組蛋白乙醯化和甲基化為例做詳細介紹。

圖2 核心組蛋白常見翻譯後修飾型別

2

組蛋白乙醯化修飾

//

組蛋白乙醯化是一種常見的組蛋白PTM，其在真核細胞基因表達的表觀遺傳調控中發揮重要作用。與其它PTM一樣，乙醯化也是一個可逆的過程，且組蛋白的乙醯化水平是由組蛋白乙醯化酶和去乙醯化酶共同決定的（圖3）。在生物體內，乙醯化和去乙醯化這兩個過程呈動態平衡，一起來調控基因的轉錄表達［5］。一般情況下，組蛋白乙醯化會啟用基因表達，而去乙醯化則會抑制基因表達［5］。

組蛋白的乙醯化經常發生在組蛋白N基末端特定的賴氨酸殘基上，比如H3K9（組蛋白3末端第9位賴氨酸）、H3K14、H3K27、H3K36、H4K5、H4K8、H4K12和H4K16等，其中研究最充分的是H3K27。一般來說，H3K27ac主要位於活躍轉錄基因的啟動子和增強子區域，在這些區域它與H3K4me3共存，一起促進基因啟用表達。此外，H3K27ac還可以基因間區域形成超級增強子，進一步促進基因表達。

現研究表明，組蛋白乙醯化與植物的各種生命過程以及人類疾病的發生息息相關，如H3K9ac在楊樹遭受乾旱脅迫時發揮作用［5］；H3K27ac在白血病中發揮重要作用［6］。目前，事實上，一些組蛋白乙醯化酶和脫乙醯化酶的啟用劑和抑制劑已被批准用於治療某些癌症的治療。

圖3 組蛋白乙醯化與去乙醯化[7]

表1 部分組蛋白乙醯化位點及功能舉例

3

組蛋白甲基化修飾

//

組蛋白甲基化主要發生在賴氨酸和精氨酸殘基上，這也是一種重要的轉錄後修飾，是由組蛋白甲基轉移酶催化完成的。其中賴氨酸殘基可以發生單甲基化、二甲基化和三甲基化，分別用me1、me2和me3表示。組蛋白甲基化可以啟用或者抑制轉錄。一般H3K4、H3K36和H3K79被認為是與轉錄啟用有關，而H3K9、H3K27和H4K20被認為是與抑制轉錄有關［11］。但同一個位點甲基化基團的個數會影響具體的功能，如H3K27me1與啟用有關，而H3K27me3則與抑制有關。多個研究表明，組蛋白甲基化在疾病發生過程中發揮重要作用，所以可以用於疾病診斷、預後以及藥物研發。

圖4 組蛋白甲基轉移酶及其在組蛋白上的賴氨酸靶向位點

表2 部分組蛋白甲基化位點及功能介紹

4

組蛋白修飾研究方法舉例

//

由此可見，瞭解組蛋白修飾並闡明其如何發揮作用對該領域的發展至關重要。近年來，組蛋白修飾方面的研究也與日俱增。在pubmed資料庫中可以看到該方向的文章數量逐年增加，僅2021年全年發表的文章數就超過900篇。說明組蛋白修飾是目前的熱門研究方向，而基礎實驗方法的發展也是促進該領域成果不斷產出的關鍵所在。組蛋白修飾研究方法有western blot、質譜法以及基於二代測序的方法等，這裡我們重點介紹常用的兩種方法—Chromatin immunoprecipitation（ChIP）-Seq和Cleavage Under Targets and Tagmentation（CUT&Tag）法。

ChIP-Seq是2009年出現的、將ChIP（染色質免疫共沉澱）和NGS（二代測序）相結合的一種方法，該方法透過抗體免疫沉澱來分離蛋白的目標修飾及其結合的基因組DNA，並將相關DNA進行片段化及測序，以此來確定組蛋白修飾在基因組上的位置及丰度（圖4）。該技術是研究組蛋白修飾在整個基因組中定位的金標準。

CUT&Tag是2019年發表的一種新方法，用於研究蛋白質與DNA的相互作用［12］。透過融合Tn5轉位酶的抗體靶向標記捕獲DNA-蛋白質的相互作用，在這個過程中把測序接頭新增到靶序列上，後透過純化DNA片段並進行測序來開展各種分析。

圖4 組蛋白PTM研究方法舉例[4]

//

兩種技術的相同之處在於，都透過特異性抗體捕獲所要研究的組蛋白修飾，後分離與組蛋白修飾相結合的DNA，並透過對DNA進行測序和分析來推斷組蛋白修飾的位置及丰度。但相比於ChIP-Seq，後者更有優勢。CUT&Tag的優勢體現在下面幾點：首先，CUT&Tag不需要進行甲醛固定和超聲打斷；第二，需要的樣本起始量更低；第三，因不需要固定，打斷等操作，所以資料信噪比高，可重複性好。也正因為此，CUT&Tag正逐漸成為研究組蛋白修飾以及組蛋白與DNA相互作用的一種重要手段。

圖5 兩種技術流程比較

5

透過ChIP-Seq技術研究組蛋白乙醯化修飾的案例解析

為方便大家瞭解上述方法如何應用於研究中，這裡小編也為大家附上一篇透過ChIP-Seq研究H3K27ac的案例供大家參考。

發表期刊：

Nat Commun

影響因子：

17。694

發表時間：

2021年9月

研究背景：

間變性大細胞淋巴瘤（ACLC）是一種侵襲性CD30陽性T細胞淋巴瘤T細胞淋巴瘤，包括全身間變性淋巴瘤激酶（ALK）陽性、ALK陰性原發性面板和乳房植入物相關的ALCL。一些ALCL亞組的預後仍不令人滿意，並且缺乏有效的二線治療選擇。為確定可定義ALCL細胞狀態和依賴性的基因，該研究透過全基因組範圍內的H3K27ac ChIP-Seq來表徵超增強子（SE）。

樣本來源：

ALCL、T細胞白血病衍生和HEK293T細胞系、FFEP樣本等。

研究方法及技術路線：

研究結論：

該研究強調了BATF3/IL-2R在ALCL生物學中的重要性，並確定靶向IL-2Rα是一種有潛力的ALCL治療策略。

研究點評：

嚴格來講，該研究使用了多組學技術聯合策略。但主要基於H3K27ac ChIP-Seq的檢測結果，再結合RNA-Seq以及基礎細胞學實驗進行後續分析，最終解析出具體調控機制以及可能的治療靶點。

參考文獻

［1］Hiroshi Kimura， Histone modifications for human epigenome analysis。 J Hum Genet。 2013 Jul；58（7）：439-45。 doi： 10。1038/jhg。2013。66。 Epub 2013 Jun 6。

［2］Jose V Torres-Perez， Histone post-translational modifications as potential therapeutic targets for pain management。 Trends Pharmacol Sci。 2021 Nov；42（11）：897911。doi：10。1016/j。tips。2021。08。002。 Epub 2021 Sep 23。

［3］Shuai Zhao， The language of chromatin modification in human cancers。 Nat Rev Cancer。 2021 Jul；21（7）：413-430。 doi： 10。1038/s41568-021-00357-x。 Epub 2021 May 17

［4］XueyuanLeng，AG（enomic）P（ositioning）S（ystem） for Plant RNAPII Transcription。TrendsPlantSci。2020Aug；25（8）：744764。doi：10。1016/j。tplants。2020。03。005。 Epub 2020 Apr 11。

［5］Verandra Kumar， Histone acetylation dynamics regulating plant development and stress responses。 Cell Mol Life Sci。 2021 May；78（10）：4467-4486。 doi： 10。1007/s00018-021-03794-x。 Epub 2021 Feb 27。

［6］Liling Wan， ENL links histone acetylation to oncogenic gene expression in acute myeloid leukaemia。 Nature。 2017 Mar 9；543（7644）：265-269。 doi： 10。1038/nature21687。 Epub 2017 Mar 1。

［7］Pingping Guo， et al。 The Histone Acetylation Modifications of Breast Cancer and their Therapeutic Implications。 Pathol Oncol Res。 2018 Oct；24（4）：807-813。 doi： 10。1007/s12253-018-0433-5。 Epub 2018 Jun 11。

［8］C Sehwan Park， et al。 Genome-wide analysis of H4K5 acetylation associated with fear memory in mice。 BMC Genomics 2013， 14：539。

［9］Shuhei Ishikura， et al。 ZFAT binds to centromeres to control noncoding RNA transcription through the KAT2B-H4K8ac-BRD4 axis。 Nucleic Acids Res。 2020 Nov 4；48（19）：10848-10866。 doi： 10。1093/nar/gkaa815。

［10］ K12 Markus Vieweg， et al。 Methylation analysis of histone H4K12ac-associated promoters in sperm of healthy donors and subfertile patients。 Clin Epigenetics。 2015 Mar 19；7（1）：31。 doi： 10。1186/s13148-015-0058-4。 eCollection 2015。

［11］ Yanjun Zhang， et al。 Overview of Histone Modification。 Adv Exp Med Biol。 2021；1283：1-16。 doi： 10。1007/978-981-15-8104-5_1。

［12］ Hatice S。 Kaya-Okur， CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells。 Nat Commun。 2019； 10： 1930。 Published online 2019 Apr 29。 doi： 10。1038/s41467-019-09982-5。

［13］ Huan-Chang Liang， et al。 Super-enhancer-based identification of a BATF3/IL-2R-module reveals vulnerabilities in anaplastic large cell lymphoma。 Nat Commun。 2021 Sep 22；12（1）：5577。 doi： 10。1038/s41467-021-25379-9。