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JBC |黑麴黴幾丁質脫乙醯酶的計算機模擬和體外分析以破譯其亞位點糖偏好

  • 由 飼料用酶結構生物學 發表于 棋牌
  • 2021-12-16
簡介在正向模式中,首先將底物本身和隨後的產物優選去乙醯化,而酶避免在亞位點 -1 放置去乙醯化單元

物相分析包括什麼

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今天推送的文章來自於2021年10月發表在Journal of Biological Chemistry上的“In silico and in vitro analysis of an Aspergillus niger chitin deacetylase to decipher its subsite sugar preferences”。通訊作者為德國明斯特大學的Bruno M。 Moerschbacher教授。

殼聚糖是一種用途廣泛且前景廣闊的生物聚合物,由 β-1,4 連線的

N

-乙醯氨基葡萄糖 (GlcNAc, A) 和氨基葡萄糖 (GlcN, D) 單元組成。在農業中顯示出植物強化和植物保護作用,或在醫學領域作藥物傳遞奈米顆粒。它們在這些領域的利用以及它們的生物學功能高度依賴於它們的乙醯化程度(DA)和聚合度(DP)的影響。幾丁質脫乙醯酶 (CDA) 存在於許多不同的生物體中,從海洋細菌到真菌和昆蟲,屬於碳水化合物酯酶 4(CE4)家族。這些酶催化從幾丁質底物中去除乙醯基,產生各種殼聚糖(正向模式);在體外,它們也能夠催化逆反應,從而N-乙醯化殼聚糖聚合物和低聚物(反向模式)。CDA 的結合位點通常由四個亞位點組成,每個亞位點包含底物的單個糖單位。據推測,GlcNAc 或氨基葡萄糖單元的亞位點偏好在它們產生的乙醯化模式中起著至關重要的作用,但到目前為止,這一特徵在很大程度上被忽略了,並且仍然缺乏有關殘基的結構資料。本文作者解析了黑麴黴CDA(AngCDA)的晶體結構,透過分子動力學模擬及體外驗證來闡明子位點偏好。由此可定製亞位點偏好以期獲得具有完全確定的結構和乙醯化非隨機模式的殼聚糖聚合物。

首先作者對AngCDA進行了異源表達,使用殼四糖(A4)作底物,確定最適溫度和最適pH分別為50℃和8。使用不同聚合及乙醯化程度的底物測試後發現,AngCDA同其它CDA一樣,對晶體底物的活性很低;當具有DA12、DA32 和 DA46 的殼聚糖用作水溶性底物時,在孵育 24 小時期間分別去除了 62%、60% 和 48% 的乙醯基。當使用不同 DP 的殼寡糖(COS)作為底物時,AngCDA 對單體 GlcNAc (A1) 無活性,但對 DP ≥ 2 有活性,活性隨著DP的增加而增加。

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為了進一步闡明底物結合位點,作者解析了AngCDA的晶體結構,AngCDA 採用扭曲的 (α/β)

8

摺疊,分子內二硫鍵 (C36–C226) 將N端和C端連線起來,穩定了結構。保守的 Asp-His-His 三元組(Nε2-H97、Nε2-H101 和 Oδ1-D48 原子)加上來自結晶溶液的丙二酸離子(O6 和 O7 原子)和一個水分子協調一個鋅 (II) 離子形成金屬-配體距離為 2。2 Å 的八面體配位幾何結構。丙二酸根離子位於預期的幾丁質底物的乙醯基通常位於並水解的亞位點0處。與其他 CE4 酶進行比較後發現,所有五個保守基序都可以在 AngCDA 中找到。為了鑑定沿 AngCDA 結合位點與底物相互作用的氨基酸,將A4、A5 和A3D1對接到了AngCDA活性位點。

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從這裡開始,結合模式將分別由非還原性和還原性末端糖單元到亞位點 0 的距離表示。例如,在子位點 0 與其非還原末端單元結合的 A4 將表示為結合模式 [0, +3]。然而,這並不表明子站點 +3 實際存在。在下文中,術語“亞位點”是指與底物的相應糖單元相互作用的酶區域,但不暗示這些相互作用實質上有助於底物結合。從不同結合模式下選擇複合物進行MD模擬,用均方根波動(RMSF)作為結合位點底物穩定性的第一指標。繫結在子位點 0 的糖單元總是顯示出最低的波動,而向正和負位點的波動都增加。底物的平均 RMSF 和不同糖單位的波動表明,與正亞位點的糖單位相比,在負亞位點結合的糖單位波動較小,從而導致跨越亞位點 -3 的結合模式的整體更穩定。以A5為對接底物,其中最低能量為結合模式 [-3, +1] ,作用模式表明中間單元首先脫乙醯,這意味著首選繫結模式實際上是 [−2, +2]。這暗示亞位點-3的次要作用。類似地,A4 和 A5 的結合模式 [-3, 0] 和 [-3, +1] 分別最低的 RMSF 值表明在這些方向上具有穩定的結合。對於所有歸類於 CE4 家族的 CDA,活性至少需要兩個糖單位。在結合自由能計算中,子位點+1對於 AngCDA 的重要性也是可見的,其中,除了子位點 0 中的糖單元之外,子位點 +1 處的糖單元顯示出最低的結合能。在子位點 +1 處觀察到的最一致的氫鍵涉及 Asp162,它在其他 CDA 中也高度保守。這個氫鍵通常在開始時就存在,而它在模擬過程中的某個時刻往往會斷裂,並且很少重新建立。這可能表明它對底物進入很重要,並且在將底物保持在結合位點方面可能起次要作用。此外,鋅離子的能量貢獻在所有模擬中都非常高,這表明鋅離子更喜歡被水包圍而不是與底物相互作用。總之,作者因此假設底物首先與亞位點 +1 的 Asp162 相互作用,並可能與亞位點 +2 的 Lys164 相互作用,然後使其取代鋅離子周圍的水分子。

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除了有助於底物結合和可能的底物進入的氫鍵之外,其他相互作用當然也起作用。一方面 Phe139 和 Leu193 之間的疏水相互作用,另一方面乙醯甲基之間的疏水相互作用十分有助於亞位點 0 的底物結合。芳香族殘基之間的堆疊相互作用,如 Tyr138 和 Tyr166,進一步促進了亞位點 0 的強結合。A4 和 ADAA 在結合模式 [-2, +1] 中的主要區別是 GlcN 單元在子位點 -1 處的旋轉,導致相鄰非還原端單元的方向完全不同。這是透過缺少乙醯基和殘基 Thr197 和 Tyr138 實現的。然而,與 GlcNAc 單元在子位點 -1 的可重複的 A4 模擬相比,GlcN 單元的這種重新定向在所有 ADaA 軌跡中都不可見。這表明,與GlcN單元相反,GlcNAc單元的能量最小值存在於亞位點−1,導致 GlcNAc 偏好。在亞位+1處具有較弱的GlcNAc偏好,這可以歸因於Asn167偶爾與乙醯氧形成氫鍵,但不與GlcN單元相互作用。在子位點 -2,Leu73 可能導致對乙醯化單位的弱偏好,但這種偏好很難用體外結果證實。

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為了驗證從 MD 模擬得出的結論並更好地瞭解 AngCDA 如何使其底物脫乙醯和N-乙醯化,將該酶與 A4、A5和 D4一起溫育。結果表明,對於去乙醯化和N-乙醯化,AngCDA 似乎更喜歡具有更高 DA 的底物。在正向模式中,首先將底物本身和隨後的產物優選去乙醯化,而酶避免在亞位點 -1 放置去乙醯化單元。在反向模式中,第一產物優選進一步N-乙醯化,可能將已經乙醯化的單元置於亞位點-1。

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整理:丁孫家

文章資訊:

PMID: 34478709

PMCID: PMC8488497

DOI: 10。1016/j。jbc。2021。101129

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