如何看懂文獻裡那些圖——Western blot

提起Western blot （WB），很多人都能哭訴半宿。

這是一個基礎實驗，也是一個讓大家頭疼的實驗，簡稱“玄學”。

“我明明按照操作步驟來，為什麼就是跑不出？”“為什麼我的 WB 總是跑得不乾淨？”，做過的都懂。

話不多說，

讓我們瞭解下WB。

什麼是WB？

Western Blot，也就是我們通常所說的“WB”，中文名稱是“

蛋白印跡

”或“

免疫印跡

”，其核心本質是抗原抗體的特異性反應。是一種被廣泛應用並得到公認的技術，用於檢測細胞或組織提取物中的蛋白表達水平。

這一技術利用抗體與特定待檢測蛋白的結合，測定生物樣本中的蛋白水平。抗體與其靶點蛋白表位的精確結合可用於檢測蛋白質中具有高度特異性的氨基酸序列。

一句話講完WB：

就是抗原抗體反應！

WB基本原

WB涉及領域

從蛋白質混合物中檢出目標蛋白質；

定量或定性確定細胞或組織中蛋白質的表達情況；

用於蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA相互作用後續分析。

WB涉及領域

WB實驗步驟

WB操作流程

WB結果圖

瞭解文獻中出現的WB結果圖，我們得先理解兩個概念：

內部參照

內參（Loading control）：即內部參照，類似於熒光定量實驗的內參基因，對於哺乳動物細胞表達來說一般是指由看家基因編碼表達的蛋白（Housekeeping Proteins），它們在不同組織和細胞中的表達相對恆定，常用它作為檢測目的蛋白表達水平變化時來做參照物。

內參的作用是什麼？

校正蛋白樣品定量以及上樣過程中的誤差，保證實驗結果的準確性；

作為空白對照，檢測WB過程中蛋白轉膜是否完全以及發光顯色體系是否正常。

內參的選擇也是一門學問，選對了內參，實驗也成功了一半。

不同部位內參蛋白展示圖

灰度值

灰度值說白了就是看這個條帶有多黑，因為跑出來的WB條帶只有一種顏色，可以給我們提供的資訊也只有黑色的深淺，所以這是我們分析條帶的關鍵。

條帶越黑說明目的蛋白越多，但是我們不能只通過觀察條帶的深淺來判斷實驗處理對蛋白表達造成了什麼影響，這種判斷是存在誤差的，誤差來源於我們上樣的時候並不能保證每個加樣孔的上樣量都一樣。

這時候就需要對 WB 的結果條帶的灰度值進行計算並做統計分析——目的蛋白的灰度值除以內參的灰度值，以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量，這樣得到的結果才更加準確、更有說服力。

常用的灰度值分析軟體有Image J、QuantityOne、Bandscan、Gel-ProAnalyzer、TanonImage等。

瞭解了內參、灰度值這兩個概念，WB結果圖（上圖）表達的意義就一目瞭然。

分析可得，p-Vav1蛋白的表達量對照組（control）要低於糖尿病組（diabetes），因為對照組條帶較淡，右側的柱狀圖——灰度值統計分析也印證了我們的初步猜想，其蛋白含量的差異具有統計學意義。Vav2、Vav3條帶的對比相對來說沒有那麼明顯，灰度值統計分析後顯示無差異。