空間代謝組整合網路毒理學和質譜成像探究何首烏D組分肝毒性機制

前言

何首烏（PM）

作為傳統中藥具有廣泛的藥理活性且臨床應用廣泛，其肝毒性一直備受關注，但由於其多成分、多靶點的特性，其毒性物質和機制尚未闡明。前期研究發現PM 70%乙醇提取物中，D組分（95%EtOH洗脫，PM-D的肝毒性最高，然而PM-D的肝毒性機制尚不清楚。

2022年8月，北京協和醫學院藥物研究所

靳洪濤、賀玖明

團隊在

Journal of Ethnopharmacology

發表了題為

“Integrated spatially resolved metabolomics and network toxicology to investigate the hepatotoxicity mechanisms of component D of Polygonum multiflorum Thunb”

，提出系統整體的

中藥毒理研究策略

，整合網路毒理學和

空間質譜成像技術

探究何首烏D組分肝毒性的潛在靶點及代謝機制，為何首烏肝毒性機制發現及中草藥的相關組分藥理毒理機制研究提供了新的方法和技術支援。

中文標題：

整合空間分辨代謝組學和網路毒理學探究何首烏D組分的肝毒性機制

研究物件：

何首烏D組分

發表期刊：

Journal of Ethnopharmacology

影響因子：

5。195

發表時間：

2022年8月

運用方法：

網路毒理學和空間質譜成像技術

研究背景

前期基於斑馬魚胚胎模型對何首烏不同組分及單體成分進行肝毒性評估，發現何首烏D組分的急性毒性和肝毒性明顯高於其他提取物，並分離鑑定了PM-D中27個化學成分，主要包含蒽醌類、多酚類、蒽酮類、二蒽酮類等，進一步以斑馬魚胚胎模型的表型終點（肝臟大小、肝臟灰度值和卵黃囊面積）評價何首烏D組分中主要化學成分的毒性，發現蒽醌和二蒽酮類與其他成分相比具有顯著的肝毒性。前期的毒性篩選確定潛在毒性物質基礎有助於進一步闡明其肝毒性分子機制。

本研究首次整合了

網路毒理學和質譜成像技術

應用於中藥毒理機制研究，網路毒理學基於系統和整體的角度衡量複雜的“成分-靶點-疾病”網路關係為中藥毒性機制探索提供了新的思路。基於質譜成像技術衍生的

空間分辨代謝組學技術

可在保留空間位置資訊的基礎上揭示生物組織中代謝物的時空分佈特徵，有助於理解代謝活動時空變化與組織病理和生理功能之間的關聯和作用機制。以何首烏D組分的肝毒性機制研究為例，兩種方法的整合應用為中藥藥理毒理機制研究提供新的研究策略。

技術流程

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研究結果

1、病理及生化指標

急性毒性實驗中，14 d內所有劑量均未觀察到小鼠死亡或異常毒性症狀且大體解剖未見明顯病理改變。2g/kg劑量反覆給藥7天后，組織病理學檢查發現給藥組肝細胞腫脹，肝竇輕度擴張，少量微肉芽腫，肝細胞輕度變性/壞死等改變，血清生化分析顯示，血清AST活性和TBIL含量顯著升高，ALT和ALP活性水平呈上升趨勢（圖1）。

圖1 | PM-D給藥後小鼠病理及生化指標變化

2、毒性物質的定量檢測

PM-D中蒽醌類化合物大黃素和大黃素-8-β-D-葡萄糖苷的含量分別為3，989。820 μg/g和12，677。423 μg/g （圖2）。反式-大黃素-大黃素二蒽酮和順式-大黃素-大黃素二蒽酮含量分別為1，847。708 μg/g和1，455。940 μg/g（圖3）。

圖2 | HPLC譜圖

標準溶液（A）和樣品溶液（B）， 大黃素-8-β-D-葡萄糖苷（1）和大黃素（2）

圖3 | MS譜圖

標準溶液（A）和樣品溶液（B）， 反式-大黃素-大黃素二蒽酮（1）和順式-大黃素-大黃素二蒽酮（2）。

3、網路毒理學分析

3.1PM-D肝毒性靶點和網路構建

經藥物靶點預測和疾病靶點收集共獲得了30個目標靶點網路構建結果顯示mTOR、PIK3CA、AKT1、EGFR、ERBB2、ESR1、RPS6KB1、CTNNB1是核心的相關靶點（圖4）。

圖4 | 網路構建及靶點分析

（A）共同靶標集合

（B）藥物-靶點-疾病網路

（C）PPI網路。

3.2 GO和KEGG富集結果分析

GO富集結果主要集中在生物過程中，涉及細胞內訊號轉導的正調控、TOR訊號、對外來生物刺激的響應、細胞對內源性刺激的反應、激酶活性的正向調節、MAPK級聯調控、凋亡過程的調控、活性氧代謝過程的調控等（圖5A）。KEGG的富集訊號通路主要包括PI3K-Akt訊號通路、ERBB訊號通路、AMPK訊號通路、mTOR訊號通路、肝細胞癌、HIF-1訊號通路、Ras訊號通路及MAPK訊號通路等（圖5B）。

圖5 | GO富集分析（A）和KEGG富集分析（B）

3.3分子對接

分子對接結果顯示大部分核心毒性成分都能與靶點緊密結合，二蒽酮類化合物順式-大黃素-大黃素二蒽酮（Cis-emodin-emodin dianthrones），反式-大黃素-大黃素二蒽酮（Trans-emodin-emodin dianthrones），Polygonumnolide C4相較於其他成分結合能更低。

圖6 | PM-D中成分與核心靶點的分子對接分析

（A）結合能熱圖分析；（B-D）結合構象視覺化：

（B）反式-大黃素-大黃素二蒽酮- mTOR；

（C）反式-大黃素-大黃素二蒽酮- EGFR；

（D）Polygonumnolide C4- mTOR。

4.質譜成像分析

4.1高分辨、高覆蓋、高靈敏的代謝物成像

質譜成像

在單個畫素點提取的代謝物峰可達數萬種，覆蓋了豐富的代謝物。作者發現兩種含量較高的藥物成分大黃素和大黃酸相關代謝產物僅在藥物組的肝臟中高度富集。內源性代謝物精氨酸和牛磺膽酸等分佈具有區域特異性（圖7）。

圖7 |

AFADESI-MSI

視覺化PM-D給藥後代謝物變化 （A）負離子模式下平均質譜

（B-E）內外源性化合物的空間視覺化：大黃素（B）， 大黃酚（C），精氨酸（D），牛磺膽酸及牛磺去氧膽酸（E）。

4.2代謝輪廓分析及差異代謝物鑑定

差異代謝物經過MS/MS鑑定，並採用MassImager軟體視覺化其空間分佈特徵，代表性差異代謝物的質譜影象如圖8所示， 可觀察到精氨酸、鳥氨酸、脯氨酸、牛磺酸類和肉鹼類代謝物顯著上調，部分脂質類代謝物顯著下調。

圖8 | 代表性差異代謝物質譜成像圖

4.3通路富集分析

基於通路富集的結果，構建了包括已鑑定的關鍵生物標誌物在內的代謝網路，揭示了膽汁酸合成、嘌呤代謝、脂肪酸氧化、三羧酸（TCA）迴圈和脂質代謝等參與了PM-D致肝毒性過程的代謝變化（圖9）。

圖9 | 代謝網路分析

研究討論

本研究首次應用

質譜成像技術

視覺化PM-D中關鍵代謝物在肝臟中的分佈並首次對PM中毒性成分二蒽酮類化合物進行定量檢測及網路藥理學分析預測潛在毒性靶標為何首烏毒性物質基礎研究及潛在肝毒性靶點發現奠定了新的基礎。

空間分辨代謝組學

進一步挖掘出何首烏D組分的肝毒性生物標誌物，包括氨基酸、醯基肉鹼、膽汁酸、脂類等。基因富集和代謝網路綜合分析表明，何首烏D組分的毒性機制可能涉及氧化應激、線粒體損傷和AMPK通路等導致的膽汁酸代謝、能量迴圈、嘌呤代謝和脂質代謝的紊亂相關，該研究有望為臨床診斷和監測何首烏肝毒性的發生發展提供參考，並作為代謝適應和重程式設計的資源，以指導未來臨床預後研究，為探索中藥毒性機制提供新思路。

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