《自然》重磅：測序技術獲重大突破！英國科學家發明新測序技術，能以前所未有的精確度研究人類任何組織的基因變化丨科學大發現

科學家終於有能力

以前所未有的精確度研究人類任何組織的基因變化

了。

近日，來自英國桑格研究院的Iigo Martincorena及其團隊在《自然》期刊發表重要研究成果，他們提出了一項新的單細胞測序技術NanoSeq，大幅提升了測序的精確度，達到前所未有的“

每測十億個鹼基對，發生的錯誤小於5個

”。

要知道，這個

錯誤率甚至遠低於體細胞變異頻率

。這將使得在任意組織或細胞中較為準確的檢測體細胞變異成為可能［1］。

更重要的是，這項研究不僅是發明了一項新的測序技術，研究人員還基於這項技術發現

細胞分裂過程中由DNA複製產生的錯誤可能不是產生突變的主要原因

。這一發現

挑戰了細胞分裂是驅動基因突變的主要機制的觀點

。

未來這項新技術還有望

讓研究致癌物對健康細胞的影響變得更容易

。

論文首頁截圖

人和人在生物學上的差異主要是由個體間DNA序列的差異導致（還有一些可能是表觀遺傳引起的），DNA序列的變化稱為變異。一般來講，變異有兩種型別——生殖細胞變異和體細胞變異。它們的區別在於生殖細胞變異可以遺傳給下一代，而體細胞變異不會遺傳。

體細胞變異是造成細胞癌變的主要原因

，而且還可能與衰老和其他的疾病（例如神經退行性疾病）有關［2］。

隨著我們逐漸老去，我們體內的細胞就會慢慢積累體細胞變異，但大部分僅存在於少陣列織的少量細胞甚至是單個細胞中，這意味著對體細胞變異的檢測比較困難。

目前DNA測序是變異檢測的主流方式，體細胞變異一般是利用單細胞測序進行檢測，但現行技術

要麼錯誤率太高了，要麼就是隻能檢測有絲分裂較為活躍的非終末分化細胞，而成年人體內大多數細胞都是終末分化細胞

［3］。

大部分癌症都始發於特定組織的一小部分體細胞變異，但是現行DNA測序技術仍然不夠準確，無法精準的識別出與少量細胞癌變有關的體細胞變異。

近年來，為了提高在單細胞（單分子）水平的測序精準度，科學家們提出採用雙重測序（duplex sequencing）對DNA的兩條鏈分別測序。

這種測序的錯誤主要來源於PCR擴增和測序過程中引入的單鏈配對錯誤

。

不過，由於DNA雙鏈是互補的，雙重測序在測了兩條互補的DNA單鏈之後，透過比對兩條鏈的測序結果，排除那些只出現在一條鏈上的變異，就可以規避掉測序錯誤。因此

理論上雙重測序的錯誤率為1個/10億鹼基對

。

雙重測序原理

Margaret L Hoang等人在2016年提出了採用雙重測序的BotSeqS［4］。然而，本研究發現在實際操作中，由於回帖和測序文庫準備過程中產生的錯誤（大部分是末端修復和缺口延伸造成），使得

BotSeqS的錯誤率達到了200個/10億鹼基對

。

為了規避文庫準備過程中由末端修復和缺口延伸引入的錯誤配對，NanoSeq使用

限制性內切酶（而不是超聲）打斷DNA雙鏈

，這樣產生的平末端無需末端修復。而對於雙鏈中產生的缺口，NanoSeq會在缺口末端引入一個雙脫氧核苷酸來終止缺口延伸。

NanoSeq的原理

本研究還開發了一套生物資訊學分析流程，用於降低測序讀段回帖錯誤。最終，

NanoSeq的錯誤率降低到了5個/10億鹼基對以下

。

接下來研究人員利用NanoSeq對多種不同的組織和細胞進行體細胞變異的檢測。

已有的研究認為幹細胞是不傾向於帶有大量體細胞變異的，但幹細胞在分化增殖過程中可能會產生變異，因此終末分化細胞會帶有更多的體細胞變異。

但研究人員在分別對造血幹細胞和粒細胞，以及結腸幹細胞和結腸上皮細胞測序後發現，

幹細胞的變異數量竟然和終末分化細胞在統計學上並沒有顯著差異

。而且終末分化細胞中的大部分突變是在幹細胞階段積累的，只有少量突變發生在增殖和分化過程中。

這表明

細胞分裂過程中由DNA複製產生的錯誤可能不是產生突變的主要原因

。

造血幹細胞和粒細胞突變數量的比較（b）以及結腸幹細胞和結腸上皮細胞突變數量的比較（d）

成年人體內大部分的細胞都是不會再分裂的，有一部分甚至是不可再生的，例如心肌細胞和神經元。這類細胞由於不會分裂，

以往研究並沒有獲得其體細胞變異頻譜

。

那麼這類沒有進行DNA複製的細胞是否會有體細胞變異，這些突變又是如何產生的呢？

研究人員對來自健康人和AD患者的前皮層神經元測序後發現，其體細胞變異數量隨年齡增長

（點突變增長17。1個/每年，13。7-20。5；插入缺失突變增長2。5個/每年，1。7-3。3）

。

而且透過對比發現，

神經元和粒細胞以及後面檢測的來自膀胱和結腸的平滑肌細胞的突變頻譜是類似的

。這表明在這類不分裂的細胞中同樣有某種機制促使突變形成，並且不同種類的體細胞之間的變異頻率沒有太大區別。

健康人和AD患者神經元的突變情況比較

對於神經元產生體細胞變異的原因，研究人員推測是因為甲基化導致胞嘧啶脫氨基化突變成胸腺嘧啶，這個突變通過後續的DNA修復得以固定下來。

很有意思的是，研究人員還發現

神經元中大於1個鹼基對的插入缺失突變高度富集於高表達的基因中，這種現象之前被發現存在於癌症基因組中

［5］。或許能解釋為何年齡與神經退行性疾病有關。

總的來講，這項基於雙重測序的技術在單細胞（單分子）水平上達到了前所未有的精度——低於5個/10億鹼基對，使得我們可以在任何組織細胞中研究體細胞變異。

利用NanoSeq我們初步瞭解到：

一直以來被認為是體細胞變異主要來源的DNA複製和細胞分裂，並沒有顯著增加分裂後細胞中的變異數量

。體細胞變異是隨著時間逐漸積累的，再一次印證了其與衰老和癌症的相關性。

在未來，由於其高精準性和非侵入性，NanoSeq或許可以用於研究體外誘導突變的風險，例如癌變風險。如果可以實現，相關領域的研究可能會邁向新的階段。

參考文獻：

［1］ Abascal F， Harvey LMR， Mitchell E， et al。 Somatic mutation landscapes at single-molecule resolution。 Nature。 2021；10。1038/s41586-021-03477-4。 doi：10。1038/s41586-021-03477-4

［2］ Kennedy SR， Loeb LA， Herr AJ。 Somatic mutations in aging， cancer and neurodegeneration。 Mech Ageing Dev。 2012；133（4）：118-126。 doi：10。1016/j。mad。2011。10。009

［3］ Petljak M， Alexandrov LB， Brammeld JS， et al。 Characterizing Mutational Signatures in Human Cancer Cell Lines Reveals Episodic APOBEC Mutagenesis。 Cell。 2019；176（6）：1282-1294。e20。 doi：10。1016/j。cell。2019。02。012

［4］ Hoang ML， Kinde I， Tomasetti C， et al。 Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal human tissues using massively parallel sequencing。 Proc Natl Acad Sci U S A。 2016；113（35）：9846-9851。 doi：10。1073/pnas。1607794113

［5］ Rheinbay E， Nielsen MM， Abascal F， et al。 Analyses of non-coding somatic drivers in 2，658 cancer whole genomes。 Nature。 2020；578（7793）：102-111。 doi：10。1038/s41586-020-1965-x