答疑專欄丨熔解曲線總是出現多峰？來看看是不是這個原因！

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GCBI的小夥伴們都超愛學習，後臺收到了大家提出的各式各樣的問題，實驗也有，分析也有。對於這些問題，小編表示完全沒在怕的，放著我來！

因為在小編的背後有著一大群專業的老師們。

為了能夠幫助到更多的小夥伴，我們決定開設答疑專欄，每週挑出比較共性的問題進行詳細解答，然後公佈在公眾號中。

本期整理了關於qPCR的問題進行解答（大家提問的時候是問題不限的哦），其中一定有你想問的，來看看吧！

1、為什麼要做3個平行孔？

嚴謹的生物學實驗，通常要求3個技術重複，而3個平行孔就是三個技術重複，是為了便於後期的生物學統計分析。

2、內標法和外標法哪種更可靠？

同樣可靠。

內標的優點

在於目標基因與管家基因的反應條件最接近一致，缺點在於目標基因與管家基因的引物和探針相互之間會發生競爭與抑制，導致它們的 PCR 效率有差異。

外標的優點

在於目標基因與管家基因的引物和探針之間沒有發生競爭與抑制的機會，但是不同管之間的反應條件差異比同管的要大，也會導致它們的 PCR 效率有差異。兩相比較，內標法與外標法的資料精確度是一樣的。

3、Ct值偏大

可能的原因是：

1。 特殊樣本：比如血清，血漿，外泌體，石蠟等。

2。 對於基因表達丰度很低的基因，也容易呈現CT值偏大的現象

3。 cDNA稀釋倍數過大，導致起始上樣量濃度過低。

4。 擴增效率低：反應條件不夠最佳化。

設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。反應體系中有 PCR 反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。

5。 PCR 各種反應成分的降解或加樣量的不足。

6。 PCR 產物太長： 一般採用 80～150 bp 的產物長度。

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資料處理時判斷資料是否能用的標準？

定量PCR資料的處理要求資料滿足下面兩個主要的條件：

擴增曲線平滑，熔解曲線單一

。

例如：如果熔解曲線為雙峰，表示為出現非特異性擴增，則其對應的資料不可用。當滿足上述條件後，還要考慮資料的重複性，這個重複性的好壞要用STDEV來衡量，STDEV＜0。5，表示這三個資料的重複性可以接受；如果大於0。5，而且三個資料中又有一個數值異於其他兩個值，可以剔除這個異常值，然後重新計算STDEV，如果小於0。5，則可以只將兩個數值進行計算，如果大於等於0。5，則考慮重新進行實驗。

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熔解曲線出現雙峰甚至多峰？

可能原因是：

1。 引物設計不夠最佳化

——與陰性對照的熔解曲線比對可判斷是引物二聚體或是非特異性擴增的影響。相應的調整引物設計，避免引物二聚體、髮夾結構或非特異性擴增的出現。

2。 引物濃度不佳

——適當降低引物的濃度（200-250 nM為宜），並注意上下游引物的濃度配比。

3。 鎂離子濃度過高

——適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的預混試劑盒。

4。 模板有基因組的汙染

——適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的預混試劑盒。

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RNA中有DNA汙染，怎麼處理？

1。 若是基因組DNA的汙染，可使用DNaseI處理RNA； 同時設定沒有逆轉錄的對照組反應檢測DNA汙染。

2。 若是受到外源DNA的汙染，可使用抗氣霧劑和UDG酶。

3。 跨內含子設計引物，排除基因組的干擾。

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如何提高RNA的質量？

先

確認RNA質檢的標準

：RNA的質量包括兩個方面：樣品的純度和完整性。RNA純度一般用NanoDrop測量吸光值的方法進行檢測，要求A260/280約在1。9~2。1之間，A260/230大於2。用凝膠電泳檢測RNA的完整性，電泳圖顯示出清晰明亮的28S和18S條帶。有Agilent 2100／4200 Bioanalyzer的實驗室可以選擇用測量RIN值的方法來進行檢測，要求RIN值大於等於７。

提高RNA的質量就要從純度和完整性兩方面進行提高

。裡面有許多需要操作的細節，無法一一列出，但一般情況下，嚴格按照試劑盒的操作說明書進行操作，即能提取出質量較好的RNA。

有一個比較關鍵的注意點：提取RNA的操作環境、所有器材需保證沒有RNA酶汙染，且操作過程最好在冰上操作。

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無反轉錄酶，對照RNA仍有擴增結果？

1。 體外轉錄時不可能將所有的DNA模板消除，因而對照組會含有痕量的DNA。建議可將第一鏈cDNA稀釋1：10、1：100、1：1000倍以消除DNA汙染造成的影響。

2。 可能是引物二聚體的條帶。

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基礎引數的如何最佳化？

1。 Mg2 + 的濃度一般來說，對以DNA 或cDNA 為模板的PCR 反應，應選擇2～5mM 濃度的Mg2 + ，對以mRNA 為模板的RT - PCR 而言，則應選擇濃度為4～8mM。

2。 模板的濃度如果研究者是進行首次實驗，那麼應選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗，以選擇出最為合適的模板濃度。基因組DNA 的模板濃度在5pg～50ng 之間選擇，質粒DNA 在106 複製數左右選擇。一般而言，使Ct 位於15～30 個迴圈比較合適，若大於30 則應使用較高的模板濃度，如果Ct值小於15 則應選擇較低的模板深度。

3。 PCR 抑制劑通常用於消除抑制子的辦法是將樣本進行稀釋，但是在某些條件下，抑制子的濃度高，而模板量少，稀釋法就不再能達到好的效果，反而會使反應的敏感度降低，所以，研究者若要進行實時定量PCR 研究，最好選用純化的模板。

4。 引物的濃度引物濃度太低，會致使反應不完全，若引物太多，則發生錯配以及產生非特異的產物的可能性會大大增加。對於大多數PCR 反應，0。 5μM 是個合適的濃度，若初次選用這個濃度不理想，可在0。 3～1。 0μM 之間進行選擇，直至達到滿意的結果。

5。 退火溫度首次實驗設定的退火溫度應比計算得出的Tm 值小5 ℃，然後在1 ℃～2 ℃內進行選擇。一般退火溫度要根據經驗來確定，這個經驗值往往同計算得到的Tm 值有較大的差距。對於定量PCR實驗而言，60℃是實驗非常常用的退火和延伸溫度。

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如何減少 RNA 模板中的二級結構？

1。 將 RNA 和引物在不含鹽及緩衝液條件下變性、退火，提高逆轉錄反應溫度；

2。 溫度超過60°C時，不能使用oligo（dT）引物，選擇一個在反應溫度可以退火的 GSP；

3。 RT-PCR 產物的長度超過 1kb時，反應溫度需保持在 65°C。

以上是我們蒐集到的一些小夥伴在做qPCR實驗的過程中遇到的問題，同時也歡迎大家在下方或後臺留言進行提問，每週我們會請專門的老師進行統一回復。

提問要求

１。型別不限，內容不限。只要是生物醫學相關的問題即可。

2。問題描述清楚明白，有圖直接上圖（留言無法放圖的話，可以發到後臺），以免沒有針對性。問題太寬泛的話，老師不好答，很可能會變成一個問題就能擴充套件成一篇文章來，但還是沒能解答你的疑惑。

還有大事商議！

我們答疑專欄的名字還沒定，請小夥伴們開動腦筋，幫忙取個清新脫俗，一看就跟那群。。。不一樣的名字來。

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還不知道基因雷達是什麼的小夥伴，還不快去複習一下。