Science新發現 |RNA以m6A依賴方式調節染色質狀態和基因轉錄

文章導讀

N6-甲基腺苷（m6A）在多種生物過程中能夠調節mRNA的穩定性和翻譯。但m6A修飾是否會對DNA轉錄或染色體開放性產生影響並未可知。於2020年1月16日線上發表在Science期刊上，論文標題為“N6-methyladenosine of chromosome-associated regulatory RNA regulates chromatin state and transcription”，打破了遺傳指令從DNA到RNA再到蛋白的單向流動固有看法，為基礎生物學研究提供了新的思路。在這項研究中，作者發現敲除小鼠胚胎幹細胞中m6A甲基化相關酶Mettl3或Ythdc1以m6A依賴的方式透過染色體相關調控RNA（chromosome-associated regulatory RNA， carRNA），增加染色質開放性，並激活轉錄。這一發現對我們理解人類疾病和藥物設計具有重要意義。

發表期刊:

Science

影響因子:

41。845

文章連結:

N6-methyladenosine of chromosome-associated regulatory RNA regulates chromatin state and transcription

研究內容

(1)m6A修飾對核內染色質的開放性及基因轉錄具有調控作用

作者研究了兩個獨立的Mettl3 KO mESCs株系（Mettl3−/−−1和Mettl3−/−−2）並分析新轉錄的RNA水平。相比於野生型WT mESCs，Mettl3 KO mESCs在的新生轉錄本明顯增加（圖1A）。作者構建了WT Mettl3或突變體Mettl3的穩定細胞系（圖S1A）。Mettl3 KO上新生轉錄本的轉錄增加這與WT中相反（圖1B）。那麼，Mettl3缺失是否會影響染色質的整體狀態。透過脫氧核糖核酸酶（DNase I）介導的TUNEL檢測發現，與野生型相比，Mettl3 KO mESCs的染色質開放性明顯增加。此外，Mettl3 WT株系中逆轉了染色質開放性的增加，表明染色質的開放性與m6A修飾相關（圖1，C和D）。綜上所述，這些資料表明RNA m6A對核內染色質的開放性及基因轉錄具有調控作用。

(2)Mettl3和Ythdc1 均會影響CarRNA的表達穩定性

透過

LC-MS/MS(雲序可提供)

發現Mettl3 KO中非核糖體染色體相關RNA （caRNAs）的m6A/A比值明顯下降（圖2A），表明m6A對caRNAs有作用。接下來對Mettl3 KO和WT mESCs中的caRNAs進行

m6A-MeRIP-seq(雲序可提供)

，Mettl3 KO後m6A水平整體下降（圖2A）。分析了三種具有潛在調控功能的caRNAs：啟動子相關RNA （paRNA），增強子RNA （eRNA）， 轉錄自可轉座元件RNA（重複RNA）。Mettl3 KO mESCs中這些carRNA的m6A水平明顯降低（圖2B）。將carRNAs分為 m6A修飾組和non-m6A修飾組，發現Mettl3 KO中m6A修飾組的轉錄丰度上調（圖2 C）。上述結果表明，m6A甲基化使這些carRNA表達不穩定。

先前研究發現，Ythdc1與負責某些非編碼核RNA降解的複合物NEXT相關，作者假設Ythdc1識別m6A標記的carRNA，並在mESCs中觸發其NEXT衰變。研究發現，在Ythdc1 CKO mESCs中發現了更多的基因間的高甲基化峰。這表明Ythdc1與Mettl3類似，主要影響基因間轉錄的caRNAs。檢測了Ythdc1敲除的carRNAs，發現重複RNA的m6明顯增加，表明Ythdc1在mESCs中影響重複RNA的穩定性。此外分析發現Mettl3 KO與Ythdc1 KO之間存在明顯的負相關，進一步表明Ythdc1促進了這些carRNA的部分衰減。核RNA衰變分析發現三組carRNA在Ythdc1 CKO上的半衰期明顯增加（圖2D），在Ythdc1 CKO後carRNA中m6A修飾組RNA的半衰期比非m6A修飾組RNA的半衰期更長（圖2E）。

(3)carRNA m6A甲基化修飾下調促進染色質開放與基因轉錄

LINE1是一類逆轉錄轉座子，在重塑染色質結構和調節轉錄中起重要作用。驗證發現L1Md_F（LINE1家族成員）以依賴於m6A的方式受Ythdc1和Mettl3調控。Mettl3 KO增加轉錄和染色質開放性（圖1），這些變化是否受到carRNA甲基化的調控？作者對新生轉錄物和全核RNA進行了

RNA-seq(雲序可提供)

和mNET-seq。在Mettl3 KO上轉錄本整體水平（圖3A和B）和轉錄速率（圖3C和D）增加。在Mettl3 KO mESCs中轉錄上調的基因往往比下調的基因在carRNA上游具有更多的m6A標記（圖3，A和B）。而且，carRNA中上游發生m6A修飾的基因比非m6A修飾的基因轉錄速率更高。表明Mettl3 KO中carRNA m6A甲基化修飾下降，激活了下游基因的轉錄。Mettl3 KO中所有m6A依賴基因carRNA上游甲基化減少（~6584個基因），它們的轉錄速率都提高了（圖3 G），這些基因主要參與轉錄調控、染色質修飾和幹細胞群體維持。因此，carRNA m6A甲基化修飾下調不但促進下游轉錄，還可能啟用與染色質開放相關的基因表達。

super-enhancers與其靶基因的互作受到mESCs中外泌體調控轉錄本轉錄的影響。檢測發現約80%的 super-enhancers RNA （seRNAs）含有m6A峰（圖3H）。Mettl3 KO上seRNAs的m6A甲基化水平降低，m6A修飾的seRNAs與非m6A修飾的seRNAs相比，轉錄丰度更高（圖3I）。Mettl3 KO中m6A水平降低的seRNAs與下游基因轉錄率升高相關（圖3J）；轉錄速率差異大於1的基因主要參與轉錄調控、染色質修飾和幹細胞維護，與其他carRNAs的結果一致。

(4)m6A調控的carRNA穩定染色質的開放狀態，並招募TFs促進轉錄啟用

那麼carRNA甲基化改變如何影響染色質狀態變化？作者進行了ChIP-seq，觀察到在Mettl3 KO上與H3K4me3和H3K27ac結合水平整體升高。此外，在Mettl3 KO mESCs中，上游發生m6A修飾的carRNA與H3K4me3和H3K27ac結合水平較無m6A修飾的carRNA更高（圖4A）。這些資料表明，Mettl3 KO mESCs中carRNA上游的穩定可增加活性組蛋白標記的沉積。作者認為carRNAs可以招募蛋白（CBP/EP300和YY1）從而促進染色質開放和啟用轉錄。

ChIP-seq(雲序可提供)

顯示EP300和YY1與Mettl3 KO mESCs結合（圖4，B和C），與鄰近eRNAs或paRNAs的高丰度相關。此外，EP300和YY1的結合均與附近的carRNA的m6A水平呈負相關（圖4，D和E），Mettl3 KO導致EP300和YY1在m6A缺失區域的結合升高（圖4，F和G）。在Mettl3 KO中同時帶有m6A修飾的carRNA和與EP300或YY1結合的基因組區域與帶有m6A或與EP300或YY1結合的基因組區域，H3K27ac的增加幅度zui大（圖4H）。對JARID2（PRC2的一個成分）進行了ChIP-seq，因為RNA轉錄本可以阻止PRC2的結合，以保持染色質的開放。因此，這些m6A調控的carRNA可以穩定染色質的開放狀態，不但透過招募活躍的TFs，還可以在甲基化缺失時排斥抑制因子，如PRC2。

(5)carRNA的m6A甲基化保持carRNA的穩定性和下游基因的轉錄

LINE1 的升高也可能調節染色質的整體開放性。作者阻斷了Mettl3−/−mESCs中LINE1 RNA的表達，觀察到染色質開放性總體降低（圖4I）。當使用dCas13b-wt FTO gRNA靶向LINE1時，觀察到LINE1的m6A水平下降，半衰期增加，染色質開放性增加。然後，將dCas13b-FTO應用於上游含有m6A標記的carRNA的基因。當使用gRNAs和dCas13b-wt FTO靶向carRNAs時，觀察到位點特異性甲基化減少，而使用dCas13b-mu FTO或陰性對照則甲基化變化很小（圖4J）。此外這些carRNAs的半衰期增加，下游基因轉錄上調，區域性H3K4me3和H3K27ac水平升高（圖4J）。上述結果表明carRNA的m6A甲基化保持carRNA的穩定性和下游基因的轉錄。

總結

在本研究中結合

LC-MS/MS

、m6A-meRIP-seq、

RNA-seq

、

ChIP-seq

等多項分子手段發現carRNA可以被Mettl3修飾並對後續轉錄具有調控作用。這些m6A修飾的carRNAs（主要是LINE1重複序列）會被Ythdc1透過NEXT複合物破壞其穩定性。其中m6A作為一個開關，能夠影響carRNAs的丰度，從而調節附近的染色質狀態和下游轉錄。m6A甲基化對carRNA的影響不同；m6A在不同細胞中可以穩定修飾carRNAs。在mESCs中，m6A缺失誘導的轉錄啟用伴隨著染色質開放性的增加、某些TFs的富集和組蛋白標記的升高，揭示了在carRNA m6A甲基化和染色質狀態之間具有直接相關性。研究結果表明，carRNA 的m6A修飾對轉錄具有額外的調控作用。

雲序生物m6A修飾研究五大模組

01 m6A RNA修飾測序

m6A RNA修飾測序（m6A-seq）

對m6A RNA甲基化，目前流行的檢測手段為m6A-Seq技術，適用於m6A RNA甲基化譜研究，快速篩選m6A RNA甲基化靶基因。雲序可提供mRNA和多種非編碼RNA的m6A測序：

m6A 全轉錄組測序（涵蓋mRNA，LncRNA，circRNA）m6A LncRNA測序（涵蓋LncRNA和mRNA）m6A Pri-miRNA測序（涵蓋Pri-miRNA和mRNA）m6A mRNA測序m6A miRNA測序

02 檢測整體m6A RNA修飾水平

LC-MS/MS檢測整體RNA修飾水平

精zhun高效，可以實現一次檢測，9類修飾水平檢測，一步到位。

比色法

快速檢測m6A整體甲基化水平

03 m6A RNA修飾上游酶的篩選

m6A RNA修飾相關酶PCR晶片

尋找上游直接調控m6A RNA甲基化的甲基轉移酶。

04 m6A RNA修飾靶基因驗證

meRIP-qPCR

雲序提供各類不同修飾的meRIP-qPCR服務，可針對mRNA，lncRNA，環狀RNA等不同型別的RNA分子進行檢測，低通量驗證RNA修飾靶基因表達水平。

05機制互作研究

5。1 RIP-seq/qPCR

篩選或驗證RNA修飾直接靶點，研究RNA修飾靶基因的調控機制。

5。2 RNA pull down -MS/WB

篩選或驗證目標RNA互作基因或蛋白，研究相應的分子調控機制。

5。3 雙熒光素酶實驗

驗證兩基因互作，研究相應的分子調控機制。

5。4 ChIP-seq

篩選或驗證目標蛋白與DNA互作，研究相應的分子調控機制。

雲序生物服務優勢

優勢一:

發表10分以上文章多的m6A RNA甲基化測序服務平臺。雲序已累計支援客戶發表

42篇

高水平文章，合計影響因子

300分+

，是國內支援發文多、累計影響因子高的公司。

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至今完成4000+例 m6A測序樣本，覆蓋醫口、農口等各類樣本。

優勢三:

檢測mRNA和各類非編碼RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。

優勢四:

提供m6A一站式服務：m6A整體水平檢測、m6A測序、MeRIP-qPCR驗證、RIP和RNA pull-down。

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率先研發超微量MeRIP測序技術，RNA量低至500ng起。

優勢六:

國內全zui的RNA修飾測序平臺，提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、O8G、ac4C乙醯化和2‘-O-甲基化測序。

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