【學術前沿】Cell Research | 湯富酬課題組開發基於單分子測序平臺的單細胞染色質可及性…

2022年10月11日，北京大學生物醫學前沿創新中心（BIOPIC）湯富酬課題組在Cell Research發表了題為scNanoATAC-seq： a long-read single-cell ATAC sequencing method to detect chromatin accessibility and genetic variants simultaneously within an individual cell 的論文，首次報道了名為scNanoATAC-seq的基於三代測序平臺（單分子測序平臺）的單細胞染色質可及性測序技術。該技術整合了長讀段單分子測序平臺和單細胞染色質可及性測序技術（scATAC-seq：Single cell Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing）的優勢，實現了在一個單細胞中同時檢測染色質開放狀態以及基因組結構變異。

scNanoATAC-seq拓展了人們對染色質可及性測序分析的認知。基於二代測序平臺（NGS）的scATAC-seq技術僅富集了染色質區域性開放區域上的基因組DNA短片段（通常80-300 bp），這些短片段被當作開放染色質（open chromatin）的訊號。然而，在使用過量的Tn5轉座酶切割並標記染色質區域性開放區域的過程中也會產生一些長片段基因組DNA，這些長片段DNA是否包含染色質狀態資訊尚不清楚。

該研究開發了基於單分子測序平臺的單細胞ATAC-seq測序技術（如圖1所示），並且探索了其在生物學問題上的應用。首先該研究利用五種人類細胞系以及在體的人類外周血單核細胞，證實了scNanoATAC-seq技術可以像基於二代測序平臺的scATAC-seq一樣根據染色質開放狀態對不同細胞型別進行準確分群並且揭示關鍵的染色質開放狀態調控資訊（如圖2所示）。

圖1。 scNanoATAC-seq實驗流程圖（左）和分析原理圖（右）

圖2。 scNanoATAC-seq對不同細胞型別進行分群的效果

接下來，該研究利用scNanoATAC-seq技術長讀段的優勢對等位基因特異性的染色質開放區域進行了準確鑑定。人體中絕大多數細胞型別都是二倍體細胞。對於二倍體細胞，基於二代測序平臺的ATAC-seq技術要區分一個染色質開放區域的兩個等位基因，需要在該開放區域（通常長度在80-300bp之間）內有雜合的單核苷酸多型性（SNP）位點。而基於三代測序平臺的scNanoATAC-seq技術要區分一個染色質開放區域的兩個等位基因，不需要該開放區域內有雜合SNP位點，而只需要在該開放區域兩側的各4000bp內有雜合SNP位點或者是雜合結構變異即可。相比於基於二代測序平臺的ATAC-seq技術，基於三代測序平臺的scNanoATAC-seq技術可以在同一個細胞系中檢測到十倍以上的等位基因特異性的染色質開放區域。scNanoATAC-seq技術可以準確地對染色質可及性訊號進行基因型分型（如圖3所示，檢測母源等位基因的準確率為99。1%，檢測父源等位基因的準確率為88。1%）。例如，應用scNanoATAC-seq技術，該研究在人類B淋巴細胞系GM12878的印記基因TRIM61的啟動子差異甲基化區域檢測到了等位基因特異性的染色質開放區域（如圖4所示，母源等位基因啟動子區域染色質處於開放狀態，父源等位基因啟動子區域染色質處於關閉狀態），而此染色質開放區域內在GM12878細胞系中不存在雜合SNP位點，不能被短讀段的ATAC-seq方法測到。

另外，該研究發現，利用scNanoATAC-seq技術在GM12878細胞系中檢測到的等位基因特異性的染色質開放區域主要富集在X染色體上。這與先前利用DNase I高敏感位點檢測方法得到的結論一致。造成等位基因特異性的染色質開放傾向於發生在X染色體的原因是在GM12878細胞系中父源X染色體被沉默的細胞遠多於母源X染色體被沉默的細胞。

圖3。 用scNanoATAC-seq技術鑑定等位基因特異性的染色質開放區域的原理圖

圖4。 用scNanoATAC-seq技術鑑定出來的印記基因TRIM61的啟動子差異甲基化區域的等位基因特異性的染色質開放區域

之後，該研究利用scNanoATAC-seq技術可以在一個單細胞中檢測染色質開放狀態的同時，還可以檢測基因組中的各種結構變異事件（插入，缺失，重複，倒位，易位等）。以人類慢性髓系白血病（CML）細胞系K562的大量細胞基因組三代測序資料為基準，該研究發現scNanoATAC-seq技術在K562細胞系（至少5個單細胞支援）中分別檢測到了7688個插入事件（佔基準的64。6%）和6120個缺失事件（佔基準的67。7%），準確度分別為93。8% 和75。5%。除了經典的BCR-ABL1易位事件，該研究也可以檢測到長達89 kb的缺失事件，該缺失事件同時截斷了ZRANB1和CTBP2兩個基因（如圖5所示）。而已知CTBP2可以抑制白血病細胞增殖，這意味著scNanoATAC-seq技術檢測到了K562細胞系中潛在的導致抑癌功能缺失的結構變異事件。此外，scNanoATAC-seq技術還可以準確檢測單個細胞的基因組複製數變異，能準確地區分出整倍體細胞和非整倍體細胞。

圖5。 用scNanoATAC-seq技術鑑定出來的ZRANB1和CTBP2兩個基因上的結構變異（大片段缺失）事件（上）以及PCR驗證結果（下）

最後，該研究利用scNanoATAC-seq技術的長讀段優勢在GM12878細胞系中檢測到了3868對染色質共開放事件。以SOX4基因上找的共開放事件為例，這些相鄰的共同開放的基因組功能元件由直接連線兩個開放區域的長讀段支援，其讀段長度分佈與非共開放區域的讀段長度分佈明顯不同（如圖6和圖7所示）。而利用基於二代測序平臺的scATAC-seq技術分析染色質共開放事件高度依賴每個單細胞的檢測覆蓋度（或者說檢測靈敏度），如果scATAC-seq的檢測覆蓋度比較低，就很難檢測到染色質共開放事件。更重要的是，即使在scATAC-seq的檢測覆蓋度很高的情況下，其中一半的染色質共開放事件的訊號是來自一個單細胞中兩個不同等位基因的共同開放（例如：等位基因#1的增強子跟等位基因#2的啟動子“共開放”），是技術假象，而基於三代測序平臺的scNanoATAC-seq技術檢測到的染色質共開放事件的訊號都是來自單個DNA分子的直接連鎖資訊，都是真實的來自一個單細胞中同一個等位基因的共同開放事件（例如：等位基因#1的增強子跟等位基因#1的啟動子共開放，或者等位基因#2的增強子跟等位基因#2的啟動子共開放），沒有上述這類技術假象。

圖6。 利用scNanoATAC-seq鑑定相鄰的調控元件共開放事件的原理

圖7。 發生在SOX4基因附近的調控元件共開放事件

綜上，scNanoATAC-seq技術擁有廣泛的生物學應用前景。該方法可以在單個細胞中同時檢測染色質可及性和基因組結構變異。該方法利用長讀段優勢可以在單個細胞中發現其內部沒有雜合SNP位點標記的等位基因特異性的染色質開放區域，這是短讀段的scATAC-seq技術無法實現的。該方法還可以發現具有直接證據支援的，發生在同一個等位基因不同調控元件上的共開放事件。scNanoATAC-seq技術的出現預示著單細胞表觀基因組三代測序時代的到來。

值得討論的是，在染色質開放程度較高的基因組DNA裸露區域，Tn5轉座酶的濃度越高，得到的DNA文庫片段越短。由此可以推斷，在使用過量Tn5轉座酶的情況下，scNanoATAC-seq技術捕獲到的長讀段的染色質開放區域中，除了通常的染色質開放區域（open chromatin）外，還可能存在開放程度較弱的染色質區域，例如寬容染色質區域（permissive chromatin），而這些是短讀段測序無法檢測到的。事實上，相較於基於二代測序平臺的scATAC-seq技術， 基於三代測序平臺的scNanoATC-seq技術檢測到了更多的核小體佔位資訊（如圖8所示）。另外，關於比對困難的基因組區域例如重複序列區域的染色質開放狀態的研究，相較於二代測序平臺的scATAC-seq，基於三代測序平臺的scNanoATAC-seq也存在明顯優勢。以上問題都值得應用基於三代測序平臺的scNanoATAC-seq技術進行深入探索，這也反映了開發scNanoATAC-seq技術的必要性。

圖8。 scNanoATAC-seq和10x scATAC-seq測序片段在轉錄起始位點附近訊號富集的情況

北京大學生命科學學院博士後胡玉瓊，博士生蔣振寰、陳坷璇為該論文的並列第一作者。北京大學生物醫學前沿創新中心湯富酬教授為該論文的通訊作者。該研究專案得到了北大-清華生命科學聯合中心、國家自然科學基金委、北京市科技委和北京未來基因診斷高精尖創新中心的支援。

論文連結：

https：//www。nature。com/articles/s41422-022-00730-x

湯富酬研究員

湯富酬，博士，北京大學BIOPIC/ICG研究員，國家“優青”（2013）、“傑青”（2016）。1998年本科畢業於北京大學，2003年在北大獲得細胞生物學博士學位，2004-2010年間在英國劍橋大學Gurdon研究所從事博士後研究， 2010年回到北京大學組建實驗室，主要從事人類早期胚胎髮育的單細胞功能基因組學研究。在國際上率先系統發展了單細胞功能基因組學研究體系，並利用一系列技術體系對人類早期胚胎髮育進行了深入、系統的研究，揭示了人類早期胚胎DNA去甲基化過程的異質性以及其他表觀遺傳學關鍵特徵，發現了人類早期胚胎中基因表達網路的重要表觀遺傳學調控機理，為人們提供了一個全面分析人類早期胚胎表觀遺傳調控網路的研究框架，加深了對人類原始生殖細胞的發育以及表觀遺傳重程式設計過程的認識。

原標題：《【學術前沿】Cell Research | 湯富酬課題組開發基於單分子測序平臺的單細胞染色質可及性測序技術》