一種啟用內源殺傷性CD8+ T細胞的白癜風小鼠模型的建立方法

白癜風是一種較為常見的面板自身免疫病，這種疾病可能導致全身性或區域性面板、毛髮或黏膜的脫色。白癜風的全球發病率約在0。5%~2%之間，目前我國有超過1千萬患者。白癜風嚴重影響了患者的容貌，絕大多數病人認為白癜風給他們帶來了極大的心理傷害，嚴重影響了他們的社交和生活。

白癜風的關鍵特徵是自體識別性CD8+ T細胞攻擊導致的黑色素細胞死亡，進而出現表皮白斑，病程較長的病人會出現毛髮脫色現象。不少研究都表明，白癜風病人體內同時存在著多種針對黑色素細胞相關抗原（包括MelanA、TYR、gp100等）的自體識別性CD8+殺傷性T細胞。

白癜風的發病誘因多樣，機制不清，因此治療較為困難。目前，不管是傳統的紫外光療或激素療法，還是新型小分子抑制劑或抗體藥物療法，都不能夠產生穩定優良的治療效果，復發機率極大。因此，需要進一步探究白癜風疾病的致病和病理程序的機制，找到新的治療靶點，以開發出更加高效、便捷的新型治療方法。而為了達到這一目的，一個好的白癜風動物模型是必不可少的。

早期的白癜風模型如Smyth雞、辛克萊豬等，不適用於大規模實驗，且沒有適用的遺傳工具能夠利用這些模型研究白癜風的機制。面板表面塗抹莫諾苯宗等化學試劑可以誘導小鼠毛髮脫色，但這種脫色來源於脫色劑對黑色素細胞的直接破壞，不依賴於殺傷性T細胞。自發白癜風小鼠模型多為TCR轉基因小鼠，這些小鼠的CD8+ T細胞攜帶識別特定黑色素細胞相關抗原的TCR，如FH小鼠（識別Tyr369-377），Pmel小鼠（識別gp10025-33）等，它們往往在成年後會自發產生毛髮的脫色，並隨年齡的增長而擴大。但單純以毛髮脫色作為白癜風發生的標準，與人類疾病不符。Harris等人還開發了一種過繼轉移Pmel T細胞的白癜風模型：對K14-SCF受體小鼠進行亞致死量輻照後，過繼轉移Pmel TCR轉基因小鼠來源的CD8+ T細胞，繼而用攜帶gp100抗原的牛痘病毒啟用。這種模型可誘導小鼠出現表皮脫色，但只有一種針對黑色素細胞相關抗原的CD8+ T細胞參與，與白癜風病人中存在多種CD8+ T細胞的參與不符；這種方法需要TCR轉基因小鼠和一種特殊的K14-SCF轉基因小鼠，限制了用遺傳學方法研究白癜風的機制；且牛痘病毒材料不易獲得，實驗操作複雜，並不適合推廣。

近日，北京生命科學研究所／清華大學生物醫學交叉研究院的陳婷課題組在Cell Regeneration上發表了題為“A mouse model of vitiligo based on endogenous auto-reactive CD8+ T cell targeting skin melanocyte”的方法論文章。文中報道了一種白癜風小鼠模型的建立方法，即在C57 BL/6背景小鼠中接種B16F10黑色素瘤細胞，接種的同時殺除Treg細胞，因黑色素瘤細胞和黑色素細胞存在共享抗原，這一操作激活了小鼠內源性的自體識別性CD8+殺傷性T細胞，從而殺傷表皮黑色素細胞，導致白癜風的發生。同時，文章介紹瞭如何使用流式細胞術及wholemount染色方法從細胞水平分析白癜風的發生和進展。此外，因成纖維細胞在白癜風疾病進展中的重要作用，文章也描述了一種體內shRNA介導的成纖維細胞特異性敲低方法。

這一白癜風模型的開發基於臨床黑色素瘤免疫治療上的發現。部分黑色素瘤患者在接受anti-PD1/PD-L1或anti-CTLA4等免疫檢查點抑制的治療後會自發發生白癜風。同時，研究表明白癜風患者體內的Treg細胞發生了功能上的失調。黑色素瘤／Treg誘導白癜風模型能夠誘導小鼠出現表皮白斑及毛髮脫色等典型的白癜風病徵，同時也能夠從細胞層面模擬人類白癜風疾病：誘導操作後33天即可觀察到CD8+ T細胞的大量浸潤以及表皮黑色素細胞的缺失。分子層面上，與白癜風患者類似，該模型中的表皮CD8+ T細胞同樣高表達IFN-γ、Granzyme A、Granzyme B、Perforin、FasL等效應因子（Xu Z， et al。， 2022）。

A。 黑色素瘤／Treg誘導的白癜風模型示意圖

B。 白癜風小鼠背部毛髮脫色和尾巴表皮白斑代表圖

C。 白癜風小鼠尾巴表皮的wholemount染色及流式分析黑色素細胞和CD8+ T細胞的分佈情況，Dct：多巴色素互變異構酶

這一模型實驗週期短，分析方法簡便，重複率高。同時，建立模型僅需簡單的實驗材料：B16F10黑色素瘤是常見的細胞系，anti-CD4是成熟的商業化抗體，小鼠也只需要C57 BL/6背景小鼠，不需要複雜的轉基因小鼠，為深入機制研究提供了方法上的便利。利用該模型，陳婷實驗室在前期的工作中發現，成纖維細胞響應IFN-γ，進一步招募殺傷性CD8+ T細胞，促進黑色素細胞的丟失（Xu Z， et al。， 2022）。

白癜風的發病誘因很多，既有遺傳傾向性，目前已有80餘個易感性相關聯的區域／基因報道；又有後天環境誘發因素，包括有害化學試劑的暴露、某些病毒的感染，以及黑色素瘤患者接受免疫抑制治療等。故難以透過一個模型模擬所有誘發因素導致的白癜風。本文報道的黑色素瘤／Treg誘導的白癜風模型能夠從外在表型、細胞層面、分子層面完全模擬人類白癜風的疾病特徵，適用於更深入的白癜風機制探究和新藥開發。但值得一提的是，這一模型早期會短暫地去除CD4+ T細胞，因此不適用於研究CD4+ T細胞在白癜風疾病發生和進展中的作用。

Reference：

Xu Z， Chen D， Hu Y， Jiang K， Huang H， Du Y， Wu W， Wang J， Sui J， Wang W， et al。 Anatomically distinct fibroblast subsets determine skin autoimmune patterns。 Nature。 2022； 601：118–24。

Cite this article：

Chen， D。， Xu， Z。， Cui， J。 et al。 A mouse model of vitiligo based on endogenous auto-reactive CD8+T cell targeting skin melanocyte。 Cell Regen 11， 31 （2022）。 https：//doi。org/10。1186/s13619-022-00132-9