Science：中科院微生物所向華李明組揭示護衛CRISPR-Cas的全新毒素-抗毒素RNA系統

Toxin-antitoxin RNA pairs safeguard CRISPR-Cas systems

Science

[

IF：41.037]

DOI：https：//doi。org/10。1126/science。abe5601

發表日期：2021-04-30

第一作者：

MingLi

1

，

2

，

3

，

†

，

*

，

Luyao Gong

1

，

3

，

†

，

Feiyue Cheng

1

，

3

，

†

，

通訊作者：

MingLi

（李明，lim_im@im。ac。cn），Hua Xiang（向華，xiangh@im。ac。cn）

作者單位：1、中科院微生物所；2、中國科學院微生物生理與代謝工程重點實驗室；3、

中國科學院大學生命科學學院

2020

年

10

月，基於

CRISPR-Cas9

系統建立的基因組編輯技術獲得了

“2020

年度諾貝爾化學獎

”

。實際上，這一革命性生物技術起源於科學家們對微生物中一種特殊的免疫系統（即

CRISPR-Cas

系統）的研究。

CRISPR-Cas

系統是在原核微生物（古菌和細菌）中廣泛存在的抗病毒（噬菌體）免疫系統。宿主菌透過將入侵病毒的特定

DNA

序列插入到其

CRISPR

結構中，可形成對該病毒的永久性“記憶”。這些記憶性序列（稱為

spacer

）可轉錄加工生成

crRNA

、指導

CRISPR-Cas

系統效應物（如

Cas9

或

Cascade

複合物）特異性識別和切割再次入侵的病毒，實現對該類病毒的適應性免疫。

CRISPR-Cas

系統豐富多樣的功能組分和核酸靶向機制，為人類提供了迄今最高效的基因組編輯技術（如

CRISPR-Cas9

系統）和基因檢測技術（如

CRISPR-Cas13a

系統），因此近十餘年來一直是生命科學研究的前沿。

CRISPR-Cas

系統在微生物基因組中穩定性維持是其抗病毒功能實現的關鍵基礎。一方面，

CRISPR-Cas

系統具有自我免疫的風險，並可能阻礙有益外源基因的獲取，因此可對宿主細胞造成適合度代價（

fitness cost

）而可能在進化過程中頻繁丟失。另一方面，微生物宿主與其病毒的“軍備競賽”中，

CRISPR-Cas

系統也會成為病毒反攻（

Anti-CRISPR

）的目標而喪失功能。面對多重的進化壓力和適應性挑戰，

CRISPR-Cas系統為何能在微生物中廣泛存在（存在於約90%的古菌和40%細菌中）併發揮其功能？在微生物宿主基因組中是否存在一類保護CRISPR-Cas功能但至今尚未被揭示的“暗物質”？這是科學家長期關注而又未能充分認識的前沿科學問題。

2021

年

4

月

30

日，國際頂級期刊

Science

以長文形式（

Research Article

）線上發表了中國科學院微生物研究所向華

/

李明團隊的最新研究成果

“Toxin-antitoxin RNA pairs safeguard CRISPR-Cassystems”

（

Li

Ｍ

。 et al。， Science 372， eabe5601

，

DOI：10。1126/science。abe5601

）。他們首次在自然界分佈最廣泛的

I

型

CRISPR-Cas

基因簇內部發現了一類特殊的

RNA“

暗物質

”

：一類前所未見的對其偶聯的

CRISPR-Cas

系統具護衛功能的一對

RNA

的毒素

-

抗毒素（

CreTA

）系統。由於

CRISPR-Cas

系統可利用

RNA

抗毒素

CreA

控制

RNA

毒素

CreT

的表達，使宿主菌無法丟失其

CRISPR-Cas

系統（對其“上癮”）。因為一旦

CRISPR-Cas

組分被破壞，就會誘導

CreT

毒素的表達，從而抑制甚或殺死該宿主菌（圖

1

），從而保護了

CRISPR-Cas

系統在細胞群體中的穩定存在。

這一

“成癮”機制的發現為理解CRISPR-Cas系統的穩定性維持和廣泛性分佈提供了全新視角，同時該文還揭示了一大類前所未知、功能多樣的小RNA（曾被稱為基因組中的“暗物質”-Nat Rev Microbiol 12(2014):647），開闢了一個全新的研究領域。

圖

1。 CRISPR-Cas

系統與

CreTA

毒素

-

抗毒素系統的互作機制

早在

2014

年，向華

/

李明團隊即利用西班牙鹽盒菌（

Haloarcula hispanica

）及其病毒在國際上建立了第一個

I

型

CRISPR

系統的高效適應模型，揭示了

CRISPR

系統對病毒高效適應需要引發的規律，並深入解析了“引發適應”過程精細的分子機制，包括

Cascade

與

crRNA

的可塑性。在這一研究過程中，他們發現了一個奇怪的現象

： 4

個成簇的編碼

CRISPR

效應複合物

Cascade

的基因（

cas6-cas8-cas7-cas5

）無法單獨敲除，但可以作為整體一起敲除，從而推測這個基因簇內部可能隱藏了一個未知的“細胞成癮”元件。

經過近

7

年的探索，他們最終在

cas6

與

cas8

之間一段僅

311 bp

的基因間區內發現了一類全新的小

RNA

毒素

-

抗毒素系統，分別命名為

CreT

（

RNA

毒素）和

CreA

（

RNA

抗毒素）。

CreTA

透過與

CRISPR

效應複合物

4

個編碼基因的結構與功能的偶聯，守護了

CRISPR-Cas

系統的穩定性（圖１）。

主要創新性發現：

１、首次發現受

Cascade

蛋白控制的小

RNA

毒素

該團隊首先透過敲除

cas6

和

cas8

基因間區的

311 bp

序列獲得

∆TA

菌株，然後基於該菌株成功獲得了

Cascade

各單基因缺失菌株。接著，他們利用攜帶這一段

311 bp

基因間區的質粒（

pTA

）轉化各突變株，發現在

Cascade

基因缺失（

∆

cas5-8

）或其單基因缺失

（∆TA∆

cas5/6/7/8

）

的菌株中，

pTA

均表現出細胞毒性（轉化效率降低約

4

個數量級），而在

Cascade

基因完整表達的

∆TA

菌株中，

pTA

的細胞毒性則被完全抑制。上述系列實驗表明，

311 bp

的基因間區產生了某種未知毒素，命名為

Cascade

抑制型毒素（

C

ascade-

re

pressed

T

oxin

），即

CreT

（圖

2A

和

2B

）。

為確定

CreT

的具體序列，該團隊透過截短實驗發現

CreT

毒性來自於一段

132bp

的序列（圖

2A

中

-54

到

+78

），其中有一個典型的啟動子序列，可起始轉錄產生了一個

78nt

的小

RNA

。突變分析進一步表明，該啟動子及小

RNA

內部一段莖環結構的突變均導致

CreT

毒性的消失（圖

2C

），說明

CreT

是一種具有細胞毒性的小

RNA

分子。

CreT

的誘導表達實驗進一步證明了其抑菌（

bacteriostatic

）而非殺菌（

bactericidal

）活性（圖

2D

和

2E

）。

圖

2 。

creTA

在

CRISPR-

cas

基因簇中的位置及功能分析

２、解析了小分子

RNA

毒素

CreT

獨特的抑菌機制

對

CreTRNA

的精細序列和結構分析表明，其５

‘

端具有強效的翻譯訊號

SD

（

Shine-Dalgarno

）序列和

AUG

起始密碼，緊接其後的是兩個精氨酸稀有密碼子

AGA，

隨後是終止密碼子

UGA

和一個莖環結構（圖３

A

）。系列突變實驗表明，上述關鍵序列和結構都是

CreT

毒性所必需。基於此，該團隊推斷了一個全新的分子迴路，即

CreT RNA

藉助強效的翻譯起始訊號定位在核糖體上，然後透過兩個串聯的稀有密碼子

AGA

進一步劫持胞內稀有的精氨酸

tRNA

UCU

，從而抑制了胞內其它重要蛋白的翻譯合成和細胞生長。基於這一猜想，他們透過過表達

tRNA

UCU

成功解除了

CreT

的細胞毒性（圖３

B

），證實了這一全新的毒性機制，即

CreT

是透過其

RNA

劫持胞內稀有的精氨酸

tRNA

發揮毒性，而非翻譯產生含二精氨酸的小肽發揮作用，因此

CreT

是一類小

RNA

毒素。

圖３

。 CreT

毒素透過劫持胞內稀有的精氨酸

tRNA

UCU

抑制菌體生長

３、發現

CreA

抗毒素——類似

crRNA

的小分子

RNA

為揭示

Cascade

蛋白抑制

CreT

毒性的分子機制，該團隊首先敲除了胞內唯一的

CRISPR array

結構，從而排除了

CRISPR array

crRNA

參與毒性抑制的可能性。對

311bp

基因間區的截短與突變實驗表明，

creT

下游序列為毒性抑制所必需（圖２

C

）。精細的序列分析和

Northern

印跡等實驗表明，

creT

下游有一段與

CRISPRrepeat

高度相似的序列（圖

2A

），該序列及其下游序列可獨立轉錄產生一個約

90nt

的前體

RNA

，並被

Cas6

加工為一個的成熟的小

RNA

（圖４

A

）。該小

RNA

約

41nt

，含有與

crRNA

一樣的完整的

5’ handle

序列（

8 nt

），特定的

spacer

序列

（

約

33nt）

，但缺乏

crRNA

常見的

3‘ handle

，因此命名為“類

crRNA

抗毒素”（

C

rRNA-

re

sembling

A

ntitoxin

），簡稱

CreA

。

CreA

作為

crRNA

類似分子，即可能聯合

Cascade

蛋白對

CreT

毒素活性發揮抑制作用。

圖４

。CreA

模擬

crRNA

指導

Cascade

特異性抑制

creT

啟動子

４、揭示

CreA RNA

聯合

Cascade

發揮抗毒素活性的分子機制

該團隊進一步揭示，與

crRNA

介導

Cascade

複合物識別外源靶序列一樣，

CreA

介導

Cascade

精確識別

creT

啟動子（圖

4B

）。

CreA

種子序列區（

5’ handle

後約

11nt

）與

creT

啟動子完全匹配（除不參與鹼基匹配的第６個核苷酸外），而其餘大部分序列不匹配。對

CreA

的

5‘ handle

序列和種子序列區的突變、以及對保守

PAM

（

protospacer adjacent motif

）序列的突變，都將導致

CreA

對

creT

啟動子抑制活性的喪失，進一步證明

CreA

聯合

Cascade

實現了對

CreT

的轉錄水平調控，從而在正常情況下可抑制

CreT

的表達及毒性。

特別需要指出的是，該團隊早期實驗已經揭示了

crRNA

的高度可塑性，其結構（如是否含有

3’ handle

序列）及

spacer

與靶序列匹配長度的不同，可以指導

Cascade

對外源靶標

DNA

實現干擾或引發適應兩種不同的生理效應。本研究進一步發現

CreA

與

creT

基因啟動子序列之間的不完全匹配性指引了多亞基

Cascade

效應物結合並抑制毒素啟動子的活性，從而實現對毒素基因的轉錄水平調控，

這在國際上首次揭示了多亞基

CRISPR

效應物固有的基因調控生理功能

。

５、揭示

CreTA

對

CRISPR-Cas

系統的護衛功能

透過研究在有無

CreTA

存在時，活躍的可移動元件

IS

（

insertion element

）對

cascade

基因的破壞行為，該團隊進一步證實了

CreTA

作為一個極簡的“成癮”元件保護

CRISPR-Cas

系統的生理功能（圖

5

）

。當

CreTA

存在時，可以保證

Cascade

基因（

cas6-cas8-cas7-cas5

）不被可移動元件插入失活，而當

CreTA

丟失後，由於

CRISPR-Cas

系統固有的適合度代價，

Cascade

基因被

IS

元件頻繁破壞。

圖

5。CreTA

保護

Cascade

基因簇的遺傳穩定性

6

、揭示

CreTA

同源或類似系統在不同微生物和不同

CRISPR

亞型中的普遍存在

該團隊還透過深入挖掘現有的微生物基因組資料，並與美國

NCBI

生物資訊領域知名專家

Eugene V Koonin

教授團隊合作，進一步發現多種古菌

/

細菌的不同型別

CRISPR-Cas

系統中潛藏著

CreTA

類似物，暗示

CRISPR-Cas

可能普遍利用

CRISPR

效應物固有的基因調控功能（如抑制一個毒性

RNA

的轉錄）對沖其適合度代價。這一全新機制的發現從新的視角解釋了

CRISPR-Cas

在微生物中的廣泛分佈。

值得特別強調的是，已知的毒素

-

抗毒素（

TA

）系統都編碼一個毒素蛋白，而該工作發現的

CreTA

利用了一個極簡的小

RNA

（

CreT

）作為毒素組分，而且其抗毒素（

CreA

）也是一個小

RNA

，並依賴於

Cascade

複合物發揮功能，因此，

CreTA

或可定義一個新的

TA

分類單元。更重要的是，這類系統全新的分子機制為基因工程和基因編輯等應用提供了重要的元件和啟示，例如，該團隊一方面已利用

CreT

開發了可在細菌和古菌中通用的極簡的反向篩選標記，為基因工程提供了新元件；另一方面基於

CreA

調控

creT

轉錄的分子迴路開發了同步實現基因編輯和基因調控的新技術（均已申請專利）。

該發現不僅在CRISPR-Cas及其偶聯絡統生物學研究中具有里程碑意義，而且為研究原核微生物“非編碼RNA暗物質世界”敞開了一道門。該論文指出在不同古菌和細菌不同型別的 CRISPR-Cas系統中發現的CreTA類似物在序列上多樣性豐富，可能蘊藏了大量未知的毒性機制和功能元件。因此，這類豐富多樣的“暗物質”的深入發掘將進一步推動生物技術的發展，包括對未來小RNA藥物的研製或將具有啟發意義。

中國科學院微生物研究所向華研究員和李明研究員為該論文的共同通訊作者，李明研究員、向華研究組博士後龔路遙和博士生程飛躍為並列第一作者。美國國立衛生研究院（

NIH

）生物技術資訊中心（

NCBI

）

Eugene Koonin

教授及其團隊給予了重要幫助。

向華研究員自2009 年獲得國家傑出青年科學基金專案資助開始CRISPR-Cas系統的前沿研究，現為微生物資源前期開發國家重點實驗室主任、微生物研究所副所長、國家重大研究計劃重點專案負責人、國家重點研發計劃專案首席科學家。李明於2009年進入向華實驗室碩博連讀並專注於CRISPR研究，於2020年獲得國家優秀青年專案資助，現為中國科學院微生物生理與代謝工程重點實驗室青年課題組長。該工作得到了中科院戰略先導研究計劃、國家重點研發計劃、國家自然科學基金、國家轉基因重大科技專項、中國科協青年人才託舉工程、中國科學院青年創新促進會等專案的支援。

論文連結：

https：//science。sciencemag。org/content/372/6541/eabe5601