什麼是親和層析法IMAC蛋白質純化？

文章標籤：組氨酸 緩衝液 咪唑 親和層析 蛋白質純化

重組蛋白的表達和隨後的

蛋白質純化

被廣泛用於生化研究。其中一些蛋白純化方法涉及使用肽親和標籤，這些標籤與目的蛋白質融合，並用於透過親和層析加速蛋白質純化。金屬親和層析法IMAC就是一種常用的蛋白純化方法，它可用於快速純化多組氨酸親和標籤蛋白，在一個純化步驟中可實現 100 倍的富集。 IMAC甚至可以以高產率獲得高達 95% 的親和標籤蛋白純度。

IMAC法的實質是利用固定化金屬親和層析 （IMAC） 來純化含有由多組氨酸殘基組成的短親和標籤的重組蛋白。IMAC 基於過渡金屬離子（Co 2+、Ni 2+、Cu 2+、Zn 2+） 固定在基質和特定氨基酸側鏈上。組氨酸是與固定化金屬離子基質相互作用最強的氨基酸，因為組氨酸咪唑環上的電子供體基團很容易與固定化過渡金屬形成配位鍵。包含連續組氨酸殘基序列的肽可有效保留在 IMAC 柱基質上。洗滌基質材料後，可以透過調節柱緩衝液的 pH 值或向柱緩衝液中新增遊離咪唑，輕鬆洗脫含有多組氨酸序列的肽。

一、蛋白質結合、洗滌和洗脫步驟的設計

多組氨酸標籤蛋白的結合可以使用柱或分批程式進行。細胞裂解應在調節至 pH 8。0 的緩衝溶液中進行。當使用柱程式時，將樹脂填充到柱中，並將細胞裂解物緩慢載入（每小時 3 到 4 柱體積）到柱上。分批程式包括在細胞裂解液中孵育親和基質樹脂，然後將樹脂裝入柱中。在 4° 孵育期間，可透過搖晃或攪拌將樹脂懸浮在細胞裂解液中。使用分批程式通常會導致更有效的標記蛋白結合。無論使用哪種方法，都建議使用最少量的樹脂來結合標記的蛋白質。與非特異性結合樹脂的其他蛋白質相比，標記的蛋白質通常具有更高的結合親和力。因此，當使用少量樹脂時，標記的蛋白質將填充大部分可用的結合位點，從而減少結合的非特異性蛋白質的數量。氯化鈉（最長 500 mM ） 和低水平的咪唑（最高 20 m M）也可以包含在結合緩衝液中，以減少與樹脂非特異性結合的蛋白質數量。

除金屬螯合劑（如 EDTA）外，大多數蛋白酶抑制劑都可以包含在所有緩衝液中。金屬螯合親和層析，又稱固定化金屬離子親和層析。該方法主要利用蛋白質表面的一些氨基酸，如組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金屬離子發生特殊的相互作用，形成穩定的螯合物從而進行分離。主要以配位鍵結合為主。

由於金屬螯合親和層析具有配體簡單、吸附量大、分離條件溫和、通用性強等特點，已成為重組蛋白質的分離純化的一個重要工具。可以用於各種表達來源（如大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳動物細胞）的組氨酸標籤蛋白質純化。金屬螯合親和層析法主要使用的實驗材料包括：Ni IDA Beads， Ni IDA Beads 6FF，Ni NTA Beads，Ni NTA Beads重力柱， HisPur Ni NTA Kit，Ni NTA Beads 6FF，Ni NTA Beads 6FF重力柱， HisCap 6FF，Ni Smart Beads，Ni Smart Beads 重力柱， Ni Smart Beads 6FF，Ni Smart Beads 6FF 重力柱， HisCap Smart 6FF等。

蛋白質純化

結合標記的蛋白質後，可以洗滌柱子以去除與柱子弱結合的非特異性蛋白質。如果需要，在洗滌緩衝液中加入咪唑（Ni 2+ –NTA 為 10–50 m M，Co 2+ –CMA 為10 m M）將增加洗滌的嚴格性並有效地洗脫非特異性結合的蛋白質。或者，可以使用 pH 值低於結合緩衝液（Ni 2+ –NTA 的 pH 為 6。3，Co 2+ –CMA 的 pH 為 7。0）的洗滌緩衝液去除非特異性結合的蛋白質。洗滌劑、2-巰基乙醇和氯化鈉等試劑通常包含在洗滌和結合緩衝液中，以減少非特異性蛋白質結合。

洗脫目的標記蛋白主要有三種方式。降低 pH 值（Ni 2+ -NTA 為 5。3-4。5 ，Co 2+ -CMA為6。0）使組氨酸殘基的咪唑氮原子質子化（p Ka 6。0）並破壞組氨酸和過渡金屬之間的配位鍵。 組氨酸類似物咪唑也可用於競爭性洗脫結合的多組氨酸殘基（Ni 2+ –NTA濃度為 100 m M或更高，Co 2+濃度為 50 m M或更高–CMA）。如果標記的蛋白質形成寡聚體，則可能需要更嚴格的條件，例如低的 pH 值或高濃度的咪唑來洗脫蛋白質。

雖然這兩種洗脫方法都有效，但多數會使用咪唑，因為暴露於低 pH 值可能會損壞目標蛋白質。但請注意，在 SDS-PAGE 之前將含有咪唑的樣品加熱至沸騰會導致酸不穩定鍵水解。相反，建議在分析前將樣品在 SDS 上樣緩衝液中加熱至不超過 37° 並保持 5 分鐘。包括螯合劑，例如 EDTA （100 m M） 在洗脫緩衝液中，可以促進蛋白質從樹脂中的洗脫。這種處理會將金屬原子從基質中剝離出來，從而導致洗脫液受到汙染。洗脫液中螯合劑或金屬的存在也可能會干擾酶活性。此外，在使用螯合劑後，如果不重新充電，則不能重複使用該基質。

二、可溶性多組氨酸標籤蛋白的天然純化方案

該實驗方案設計原理是在非變性條件下使用 Ni 2+ -NTA 樹脂從大腸桿菌中純化帶有六個 N 末端組氨酸殘基的可溶性 ERK2 蛋白。雖然這種方案可能需要對其他多組氨酸標籤蛋白進行輕微的最佳化，但它是作為純化天然狀態下可溶性蛋白的起點。實驗過程中，可以將尿素或鹽酸胍新增到緩衝液中，以在變性條件下執行純化。也可以在緩衝液中新增其他試劑，包括去汙劑、2-巰基乙醇和各種蛋白酶抑制劑，也可以新增到緩衝液中以防止非特異性結合或蛋白水解。

使用鎳-次氮基三乙酸 （Ni 2+ -NTA） 基質對具有代表性的多組氨酸標籤蛋白純化進行 SDS-PAGE 分析。圖中顯示了等體積的細胞裂解物、在分批步驟中未能與樹脂結合的穿透材料、將樹脂裝入柱子後獲得的洗滌材料以及柱子的洗脫液。透過考馬斯染色使 15% Laemmli 凝膠視覺化。

蛋白質純化

步驟如下：

1。透過在載入緩衝液（300 m M NaCl、50 m M NaH 2 PO 4、pH 至 8。0 用 NaOH）中的冰上超聲處理來裂解表達標記蛋白的細胞。每克細胞應使用大約 3–5 ml 上樣緩衝液。儘可能保持裂解液低溫，以儘量減少可能的蛋白水解。

2。透過在 4° 下以 30，000 g旋轉 30 分鐘立即離心裂解物。

3。將在冰冷載入緩衝液中預平衡的50% Ni 2+ -NTA 漿液 （Qiagen） 新增到上清液中。加入足量的 50% Ni 2+ -NTA 漿液以結合多組氨酸標籤蛋白（5–10 mg/ml 樹脂）。以 4° 攪拌或旋轉 1 小時。

4將樹脂載入到柱子上。用 20 柱體積的 4° 上樣緩衝液清洗樹脂。

5。在 4°下用 20 柱體積的洗滌緩衝液洗滌樹脂（與上樣緩衝液相同，但也含有 10 m M咪唑，pH 至 8。0 與 HCl）。

6。 在上樣緩衝液中使用 20 柱體積梯度 10 至 250 m M咪唑進行洗脫（pH 至 8。0，使用 HCl）。收集 1-ml 級分並使用 SDS-PAGE 分析含有所需蛋白質的級分並彙總。