「開講啦」如何提取菸草葉綠體蛋白？

本文翻譯自Bio-protocol （https：//bio-protocol。org/cn/Default。aspx）。Bio-protocol是為一線科研人員服務的期刊，其專精於遴選、發表從基礎到高階、從傳統到創新的各種實驗方案。

摘要

這種快速的方法可以從本氏菸草葉片中提取葉綠體富集的蛋白，葉綠體富集的蛋白被瞬時轉化為表達一個感興趣的表位標記蛋白。因此，當它與Western blot分析相結合時，可以作為研究相關蛋白葉綠體定位的工具。

農桿菌介導的轉化（Agroinfiltration， Romeis et al。， 2001）可以在菸草葉片中瞬時表達攜帶表位標籤的蛋白。另外，與含土壤傳播小麥花葉病毒19K的農桿菌菌株共滲透可以抑制轉錄後基因沉默，從而提高轉化效率 （Te et al。， 2005）。

轉化葉片的葉綠體分離方法是基於Romeis等人（2001）稍作修改後的方法，包括細胞壁和細胞膜的機械破裂，過濾去除未破碎的組織，以及透過Percoll層離心分離完整的葉綠體。

材料和試劑

1。 本氏菸草植株；

2。 攜帶重組雙元質粒的根癌農桿菌（

A。tumefaciens

）菌株GV3101，其中感興趣的基因融合在表位標籤上；

3。 攜帶19K的農桿菌GV3101；

4。 胰蛋白腖（AppliChem GmbH，產品目錄編號：403682。1210 ）；

5。 酵母膏（AppliChem GmbH，產品目錄編號：A1552，0500 ）；

6。 蔗糖（AppliChem GmbH，產品目錄編號：A2211，0500）；

7。 MgSO4（默克公司，目錄編號：105886）；

8。 適當的抗生素；

9。 瓊脂（卡爾·羅斯，目錄編號：2266。2）；

10。 乙醯丁香酮（Sigma-Aldrich，目錄編號：D134406）；

11。 MES緩衝液（卡爾·羅斯，目錄編號：4256。3）；

12。 液氮；

13。 細胞分離液（通用電氣醫療保健，目錄編號：17-0891-01）；

14。 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）（卡爾·羅斯，目錄編號：8040。1）；

15。 二硫蘇糖醇（DTT）（產品目錄編號：A2948）；

16。 MgCl2（默克公司，目錄編號：105833）；

17。 甘油（AppliChem GmbH，產品目錄編號：A3739，0500）；

18。 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（卡爾·羅斯，目錄號：9105）；

19。 山梨醇（默克公司，目錄編號：56755）；

20。 牛血清白蛋白（卡爾·羅斯，目錄編號：8076。2）；

21。 無EDTA蛋白酶抑制劑（羅氏診斷公司，目錄編號：11 836 153 001）；

22。 YEP培養基（見配方）；

23。 混合劑緩衝液（見配方）；

24。 分離緩衝液（見配方）；

25。 蛋白提取緩衝液（見配方）。

裝置

1。 1ml注射器（Terumo醫療公司，目錄編號：BS-01H）；

2。 4°C冷凍離心機；

3。 47μm尼龍網（卡爾·羅斯，目錄編號：XA63。1）；

4。 2ml圓底玻璃均質器（A。 Hartenstein，目錄編號：HOG2）；

5。 帶有相位反差聚光鏡和相位反差相容物鏡的光學顯微鏡，如物鏡LD A-Plan 40x/0。5 Ph2（ZEISS）；

6。 恆溫振盪培養箱；

7。 旋轉搖盪器；

8。 OD600光譜儀；

9。 1。5ml反應管（SARSTEDT AG，目錄編號：72。706）；

10。 50ml錐形離心管（SARSTEDT AG，目錄編號：62。548。004）。

步驟

1.本氏煙的瞬時轉化

（1）將含有19K的農桿菌GV3101和攜帶目的基因（帶有表位標籤）載體的農桿菌GV3101分別在含有適當抗生素的YEP瓊脂平板上劃線。在28℃下孵育48h，獲得單克隆。

（2）將培養不超過1周的培養皿中的單個菌落接種到含有15ml YEP培養基（含有適當的抗生素）的50ml離心管中，在28°C、180rpm的條件下過夜。

（3）第二天，將過夜培養物（OD600在1。0~1。5之間）在室溫下以2500×

g

離心10min，捨棄上清液。

（4）將離心收集的農桿菌重新懸浮在5ml混合緩衝液中。

（5）室溫條件下，在旋轉搖床上以120rpm的轉速暗培養2h。

（6）將兩種細菌懸液（19K、目的基因）混合，前者20%、後者80%，最終OD600在0。5至1。0，用於目的基因的瞬時表達。

注：由於19K抑制基因沉默，侵染混合物中19K的比例已被證明可以有效地增強幾種蛋白的瞬時表達。然而，對於其他蛋白質的最佳比值可能會有所不同。侵染混合物OD600高於1。0可能導致對菸草的毒性影響。

（7）將無針頭注射器的尖端壓到3-4周齡、水分充足的下葉表面，注射混合菌液。用第三、第四和第五個的葉片進行農桿菌侵染（圖1A）。每一片葉子一次注射100-150µl的混合物。用記號筆標記葉片上的浸潤區域（圖1B）。

注：在農桿菌侵染的第一天早晨給植物澆水是很重要的。否則，農桿菌很難在不破壞組織的情況下成功滲入葉片組織。

圖1 農桿菌侵染過程。數字為3、4和5的葉片最適於農桿菌侵染，侵染區域用記號筆做了標記。

2.瞬時轉化本氏菸葉綠體的分離

說明：為了獲得完整的葉綠體，應在暗迴圈結束時從菸草植株中收穫植株材料，並將其儲存在黑暗中，以避免在離心過程中過量積累澱粉，導致葉綠體外殼破裂。此外，所有實驗步驟都應在4℃條件下進行。

（1）在農桿菌侵染2-3天后，將瞬時轉化的植物材料，用預冷玻璃均漿器在400μl冰分離均質液中均質。

（2）勻漿透過47μm的尼龍網過濾，並在冰上和黑暗中儲存。

（3）40% Percoll層的製備：將132µl的Percoll層與198µl的分離緩衝液徹底混合，將40%的Percoll層沉積在1。5ml反應管的底部。

（4）將400µl含有勻漿的過濾葉綠體小心地放置在40% Percoll層上，在4°C，7000×

g

條件下離心1min。完整的葉綠體將以綠色的顆粒沉積，而破碎的葉綠體仍然在Percoll層的頂部（圖2）。

注：1。另外，完整的葉綠體的離心也可以在1700×

g

下更溫和地離心6min。

2。棄上清液，將葉綠體在小體積（20-30µl）的分離緩衝液中輕輕重懸浮。富含葉綠體的懸浮液儲存在冰上。

圖2 透過40% Percoll層離心後從完整的葉綠體中分離。

（5）用相差顯微鏡證實了顆粒狀葉綠體的質量。完整的葉綠體顯得不透明，周圍有一個光暈（圖3A）。破碎的葉綠體表現出深綠色、顆粒狀和無折射的外觀。

圖3 在相差顯微鏡下可見完整的葉綠體和破碎的葉綠體。

（6）隨後，以4°C、1000×

g

離心5min，使葉綠體成球，取出並丟棄上清液。

（7）在液氮中休克冷凍葉綠體。

（8）冷凍斷裂的葉綠體在50µl冰冷蛋白提取緩衝液中重新懸浮，4°C、15000×

g

離心10min。

（9）將上清液（含有可溶性葉綠體蛋白）轉移到一個新的離心管中。

（10）富含不溶性葉綠體蛋白的顆粒在50µl冰冷蛋白提取緩衝液中重新懸浮。

（11）樣品可以儲存在-70℃或直接用於Western blot分析，以比較葉綠體部分和瞬時轉化菸草葉片總粗提物中的蛋白表達。

注：從100mg葉片材料中分離的葉綠體蛋白的總產量在10-20g之間。5-10g可用於Western blot分析。

配方

1。YEP培養基

0。5%胰蛋白腖（m/v）

0。5%酵母膏（m/v）

0。5%蔗糖（m/v）

50mM MgSO4

固體培養基：加入1。5%瓊脂（m/v）

對YEP培養基進行高壓滅菌

2。混合緩衝液（必須新鮮配製）

10mM MES（用1M KOH調整pH值為5。8）

10mM MgCl2

150μM乙醯丁香酮

3。分離緩衝液（必須新鮮配製）

0。33M山梨醇

50mM 羥乙基哌嗪乙硫磺酸（用1M KOH調節pH為7。0）

0。1%（m/v）牛血清白蛋白

2mM EDTA

1mM MgCl2

4。蛋白提取緩衝液（必須新鮮配製）

10%（m/v）甘油（來自高壓滅菌原液）

5mM EDTA（來自高壓滅菌原液）

10mM DTT

100mM HEPES（用1M KOH調節pH為7。2，無菌過濾）

蛋白酶抑制劑

References：

1。Pineda， M。， Sajnani， C。 and Baron， M。 （2010）。 Changes induced by the Pepper mild mottle tobamovirus on the chloroplast proteome of

Nicotiana benthamiana

。

Photosynth Res

103（1）： 31-45。

2。Romeis， T。， Ludwig， A。 A。， Martin， R。 and Jones， J。 D。 （2001）。 Calcium-dependent protein kinases play an essential role in a plant defence response。

EMBO J

20（20）： 5556-5567。

3。Te， J。， Melcher， U。， Howard， A。 and Verchot-Lubicz， J。 （2005）。 Soilborne wheat mosaic virus （SBWMV） 19K protein belongs to a class of cysteine rich proteins that suppress RNA silencing。

Virol J

2： 18。