新型奈米銀-磷酸鋯-中性紅複合膜修飾電極，對過氧化氫電催化還原

摘要

製備了新型奈米銀-磷酸鋯複合材料，對中性紅有強烈吸附。吸附的中性紅表現出更強的氧化還原性，氧化還原中點電位與溶液中（pH 7）相比正移約200 mV。將辣根過氧化酶與複合材料共同修飾在電極表面製成酶電極，對H202有顯著電催化還原作用。催化電流在2。5 *10- 6 ~ 2。 0 * 10- 3 moI/L 範圍內與H202濃度成正比；H202檢出限為2。 0* 10- 7 moI/L（S/N = 3）；感測器對1。 0 *10- 5 moI/L H202響應時間< 15 s；RSD 為1。4%（n = 10）。4℃儲存6 個月該電極仍有85%以上初始響應。感測器有效消除了抗壞血酸等共存物質的干擾，回收率實驗結果令人滿意。

背景

中性紅（NR）是優良電子轉移介體，因水溶性大，製得修飾電極穩定性差，將NR 聚合在電極上可提高穩定性。

聚NR 修飾電極對抗壞血酸、多巴胺及腎上腺素等有電催化作用。但是在維持酶催化活性的pH 下，單體和聚NR 還原電位都太負，催化底物還原時共存物質干擾嚴重。許多酶如辣根過氧化酶在過低電位下會喪失催化能力，使得NR 不能用於構築H202感測器。

磷酸鋯（ZP）是優良的離子交換劑，常用來固定電子轉移介體。介體固定在ZP 上，氧化還原中點電位［Em =（Epa + Epc）/2］正移約300 mV，可有效電催化氧NADH。

將物種包合到類似基質中成為調製電對電位的有效途徑。包合後介體的氧化還原電位不隨底液pH 而改變，十分有利於構築酶電極。

奈米金屬膠粒在水溶液或表面活性介質中具有高度反應性，能催化氧化還原反應，但其在溶液中易聚集喪失催化活性。Sun 等以沸石為載體制備奈米金屬微粒穩定性好，為光催化分解水的機理研究提供了模型。此法制備奈米金屬粒子需要多步驟，可能使金屬離子未被完全還原，限制奈米金屬顆粒催化應用。本實驗透過直接浸漬法制備奈米銀

和磷酸鋯複合材料

，並將NR 吸附在複合材料中固定在電極表面。複合膜中ZP 大大正移了NR 氧化還原電位，有

效防止了其流失

。

複合膜中奈米銀了ZP 吸附NR 能力，促進了NR 氧化還原反應並保持了ZP 電位調製能力。

吸附態NR 對H202具有顯著的催化還原能力。感測器表現出寬的線性範圍和快的伏安響應，並具有良好的穩定性和重現性，特別是大大降低了共存物質干擾，具有極好的選擇性。

試驗

1、H2O2感測器的製備

直接購買綿竹耀隆化工磷酸鋯ZP；奈米銀和磷酸鋯複合材料製備請聯絡耀隆化工。將奈米銀磷酸鋯（Ag0n -ZP）複合物在水中充分溶脹，製成40 g/L 膠體。取此膠體50μL 加入10μL 3% PVA、20μL 含0。 1 moI/L KCI Tris-HCI 緩衝液（pH 7），3 mgHRP，3 mg BSA 和10μL 5%戊二醛，迅速攪拌均勻。取10μL 該混合液滴塗在預處理過的玻碳電極表面，自然乾燥成膜。再置於5。0 X 10- 4 moI/L NR 溶液中浸15 min，染料分子吸附到修飾膜中，製成H2O2生物感測器。感測器水洗後置於含0。1 moI/L KCI Tris-HCI 緩溶液（pH 7）中，在- 0。 8 ~ 0。 8 V 間迴圈掃描至訊號電流穩定為止。電極不用時儲存在4C PBS 緩衝液中（pH 7）。

2、測定方法

（1） 迴圈伏安法三電極系統插到Tris-HCI 緩衝液中，通入高純氮除氧後在- 0。 80 V ~ 0。 80 V 間作迴圈伏安圖；

（2）恆電位電流法溶液同（1），插入三電極系統，恆定電位於- 0。 4 V，調整基線穩定後迅速加入H2O2標準溶液；溶液通氮氣除氧後，測定其電流值，此值與基線電流差值為訊號電流。

結果與討論

1、吸附在Ag0n-ZP 膜中NR 電化學性質

吸附在奈米銀Ag0n -ZP 膜中NR，在含0。1 moI/L KCI Tris-HC（I pH 7）緩衝液中！ 為100 mV/s時，Em約為- 0。35V，比NR 正移約200 mV，故適合於電催化辣根過氧化酶對H2O2還原反應。吸附態NR Em隨υ增大，略有負移，ΔEp增大，表明吸附過程不可逆。吸附態NR 的ipa、ipc與υ 和υ½都為非線性關係，表明電極反應由吸附和擴散過程共同控制。溶液中NR Em隨支援電解質pH 呈線性變化，而吸附在膜內的NR Em不隨支援電介質的pH 改變而變化，在pH 4 ~ 9 範圍內始終保持在- 0。35 V。另外，峰電流也不隨溶液pH 而改變，這有利於構築化學和生物感測器。

2、Ag0n對ZP 吸附NR 能力的增強作用

ZP 修飾電極和ZP-Ag0n修飾電極在5。 0 X 10- 4moI/L NR 溶液中浸泡15 min 前後，在Tris-HCI 緩衝液中的迴圈伏安圖（見圖1）。

與Z

P 修飾電極相比，在ZP-Ag0n修飾電極上，NR 氧化還原峰電位略微負移，而峰電流卻明顯提高，說明膜中Ag0n大大增強了ZP吸附NR 能力

。Ag0n在測定電位範圍內也有電活性，氧化峰尖而窄（ Epa≈0。 08 V），無還原峰。這些電活性的奈米銀微粒大大提升了NR 峰電流，其主要原因是：

（1）奈米級銀簇具有卓越的吸附效能，它作為共吸附劑大大提高了電極表面NR 區域性濃度；高度分散的奈米Ag0n帶有過剩負電荷，與荷正電的NR 分子存在靜電相互作用，使NR 與Ag0n結合更緊密，並且在膜中增加了新吸附點，提高了NR 電化學響應；

（2）奈米銀簇過剩自由電子向吸附的NR 轉移時在粒子與溶液間產生電位差，該電位差在單質銀氧化過程中還原所吸附的NR，因而提高了吸附態NR 電活性。

3、H202生物感測器製備

預備實驗發現酶容易脫落流失，感測器訊號不穩定。本實驗將酶、戊二醛和BSA 摻到ZP-Ag0n複合物膠體中，滴塗到電極表面乾燥成膜，再在NR 溶液中浸15min，將介體和酶固定於膜中。此法制備感測器酶層不易脫落，且方便了NR 在酶和電極間進行電子傳遞。另可吸附NR 均勻分散於膜內，更多介體可以接觸到酶活性中心，製得的感測器響應更靈敏。

4、感測器對H202催化還原

圖2（a）是ZP-Ag0n -HRP 和ZP-Ag0n -HRP-NR 電極在加入H2O2前後的迴圈伏安圖。由圖（a）可知膜中Ag0n也能電催化H2O2還原，但不明顯，與NR 電催化作用相比可忽略不計。由圖2（b）可知，當無H2O2時，ZP-Ag0n -HRP-NR 電極只表現出NR 的氧化還原峰（1），加入H2O2後，NR 還原峰明顯增加，而還原電位基本不變，證明此還原峰仍為NR 還原所致。相同條件下基體電極和ZP-Ag0n -NR 膜修飾電極（不含酶）對H202無響應，表明固定在修飾膜內的HRP 對H202有明顯催化還原作用，膜內的NR 是該反應體系有效電子轉移介體。還原電流增加幅度與H202濃度成正比，可用於H202定量測定。反應機理推斷如下：

5、酶和介體用量的影響

膜中固定酶用量增加，感測器響應靈敏度增加。但酶量過大又使得線性範圍變窄，本實驗選擇3 mg（90μL）HRP 為最佳用量。將ZP-ag0n -HRP 修飾電極置於5。0 X 10- 4 moI/L NR 中浸泡15 min 即達到飽和吸附，故選擇最佳吸附時間為15 min。生物感測器在pH 5 ~ 7 範圍內對H202有好的響應，pH 7。0 為最佳。

6、工作電位的選擇

當工作電位在- 0。3 ~ - 0。7 V 間變化時，工作電位越負，靈敏度越高，同時溶液中共存電活性物質也越容易還原，測定干擾越大。實驗選擇

- 0. 4 V

為最佳工作電位

7、感測器響應時間

修飾層厚度由滴在電極表面膠體體積來控制。體積越大，修飾層越厚，響應時間越長。本文選擇

10μL

為最佳用量。此時，感測器對H202有快的伏安響應，達95%穩態電流所用時間< 15 s （見圖3）

8、感測器穩定性

由於ag0n與NR 分子強烈的相互作用，大大增強了膜對染料的吸附能力，ZP-ag0n -NR 修飾電極與ZPNR電極相比，顯著提高了穩定性。另外，ag0n還增強了膜機械強度，H202感測器連續工作10 d 電流響應基本不變。感測器在4C冰箱中放置6 個月，其活性保持85%以上。在含1。 0 X 10- 5moI/L H202溶液中，RSD 為1。4%（n = 10），說明感測器重現性很好。

9、感測器抗干擾能力

感測器在Tris-HCI 緩衝液中固定H202為0。5 mmoI/L，E為- 0。4 V，對抗壞血酸、蔗糖、葡萄糖、L-乳酸、檸檬酸、L-色氨酸和NO-3、F- 、K+ 、Ca2 + 、Mn2 + 、Cu2 + 可能造成的干擾進行實驗。因為ZP 正移了吸附態NR 氧化還原電位，此H2O2感測器有效避免了大多數共存物質干擾。

10、校準曲線和回收率

由於NR 快速有效地傳遞電子，該感測器靈敏度很高。圖3 是感測器對不同濃度H2O2響應的電流-時間曲線（E 為- 0。4 V）。校準曲線由不同濃度H2O2計時電流曲線作出，線性範圍為2。 5 X 10- 6 ~ 2 X 10- 3mol/L；檢出限為2 X 10- 7mol/L（S/N = 3）。校準曲線按濃度數量級分段繪製，如表1。在Tris-HCI（ pH 7）緩衝液中，E 為- 0。4 V，用標準加入法進行回收率實驗，回收率在97。0% ~ 102。0%之間，結果令人滿意。

結論

磷酸鋯（ZP）是優良的離子交換劑，常用來固定電子轉移介體。介體固定在ZP 上，氧化還原中點電位［Em =（Epa + Epc）/2］正移約300 mV，可有效電催化氧化NADH。將物種包合到類似基質中成為調製電對電位的有效途徑。包合後介體的氧化還原電位不隨底液pH 而改變，十分有利於構築酶電極。