非靶向代謝組學探究胰腺導管腺癌患者對免疫檢查點阻斷的反應

前言

胰腺導管腺癌

（PDAC）

是一種高致死率的癌症，預後不佳。由於高度免疫抑制的腫瘤微環境（TME），免疫療法不能改善PDAC患者的臨床表現。而有研究表明，腸道菌群可以決定癌症的進展和免疫治療反應，比如來自長期PDAC患者（可能具有一定的抗腫瘤因子參與）的腸道菌群具有一定的抗腫瘤作用。這種抗腫瘤作用可能與TME的免疫反應有關。腸道菌群可以產生多種代謝物，比如促炎代謝物氧化三甲胺（TMAO），由食物中膽鹼經腸道菌的膽鹼TMA裂解酶轉化為TMA，而後TMA進入門靜脈，在肝臟中氧化為TMAO。研究表明，TMAO可以啟用免疫。

因此，本篇作者採用多組學的方法對TMAO抗腫瘤的效果及機制展開研究。

2022年9月，費城Wistar研究所的

Rahul S.Shinde

團隊在

Science Immunology

（IF：30。63）發表了題為

“The microbiome-derived metabolite TMAO drives immune activation and boosts responses to immune checkpoint blockade in pancreatic cancer”

的研究成果。該文章使用

非靶向代謝組學、轉錄組學（RNA-seq）及單細胞轉錄組學（scRNA-seq）、熒光流式

對TMAO對PDAC腫瘤生長以及巨噬細胞的影響展開研究。

研究思路

研究結果

1、腸道微生物衍生的TMAO驅動PDAC中TME的免疫啟用並減少腫瘤生長

首先作者採用抗生素甲硝唑改變小鼠腸道菌群，以觀察腫瘤生長的變化。結果發現甲硝唑可以明顯增加腫瘤大小（圖1A）。透過對小鼠

血清的非靶代謝組學

分析發現，受影響最大的是TMAO，平均減少了約73倍（圖1B）。透過腹腔注射外源TMAO或者TMA，發現腫瘤大小和重量明顯減少。

透過

熒光流式分析

發現，TMAO或TMA處理後，腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）中主要組織相容性複合體I類（MHCI）、MHCII和CD86等刺激性標誌物的表達增加；同時，抗炎標誌物Arg1的表達明顯減少，共同表明向免疫刺激性TAM表型轉變（圖1E和F）。效應性T細胞的啟用大幅增加，表現為IFN-γTNF-αCD8和CD4 T細胞的百分比增加，以及CD8和CD4v+T細胞上的啟用標誌物CD44增加（圖1G）。

此外，血清中的TMAO水平與IFN-γTNF-αCD8 T細胞的百分比呈正相關，與腫瘤重量呈負相關。此外，TMAO也激活了小鼠外周器官及淋巴組織的免疫。這些結果說明TMAO或TMA可能透過重新配置腫瘤環境，使其處於免疫啟用狀態而抑制腫瘤生長。

誘導外周組織的免疫啟用可能有助於TMAO的腫瘤抑制作用。

圖1 | TMAO或TMA驅動PDAC的TME中免疫啟用

2、飲食中的膽鹼或腸道菌TMA裂解酶可以複製TMAO導致的表型

隨後作者透過向食物中增加膽鹼來驗證這一結果。透過

非靶代謝組學分析

發現，補充膽鹼的小鼠中TMAO和TMA的水平增加，且與PDAC尺寸的明顯減少有關（圖2A和B）。而且，補充膽鹼導致的免疫刺激作用與直接給予TMAO相似。具體來說，在TAMs上MHCI和MHCII等刺激標誌物的表達明顯增加（圖2c）。也觀察到其他先天性免疫細胞的啟用標記增加，包括CD11bLy6CLy6G-單核骨髓源性抑制細胞（MDSCs）（M-MDSC）、CD11b Ly6CLy6G多核MDSCs（PMN-MDSC）和抗原呈遞的CD103+樹突狀細胞（DCs）。這些分析還顯示了活化的CD8和CD4T細胞的明顯增加，如IFN-γTNF-αCD8和CD4T細胞百分比的增加與活化標誌物CD69的增加有關（圖2D和圖S4D和E）。而TMAO的產生取決於腸道菌群酶CutC/D的活性。

為研究CutC/D酶活性是否是TMAO抗腫瘤作用所必需的，作者使用CutC/D酶抑制劑氟甲基膽鹼（FMC）抑制CutC/D活性。結果發現，FMC處理後明顯降低了迴圈TMAO水平，與甲硝唑相似（圖2F）。與對照組相比，FMC治療還與PDAC負擔的明顯增加有關（圖2G）。此外，FMC明顯增加了Arg1的表達，同時減少了TAMs上的MHCII，表明TAM免疫刺激表型的整體減少（圖2H）。CD103DCs的免疫刺激表型也減少了，表現為MHCI和IL-12p40表達的減少（圖S4G）。最後，IFN-γTNF-αCD8和CD4 T細胞的百分比明顯下降，這表明效應性T細胞反應下降（圖2I）。這些資料表明，TMAO誘導的TAMs和其他免疫細胞的免疫刺激表型至少部分是由於腸道細菌酶CutC/D的活性。

圖2 | 飲食及腸道菌群干預複製了TMAO的抗腫瘤效果

3、TMAO驅動了PDAC免疫浸潤中的抗腫瘤轉錄作用

接下來，作者為了解TMAO對TAMs的影響，採用

轉錄組學RNA-seq

對TAMs進行研究。結果發現，TMAO處理組的1736個基因轉錄物發生了明顯的變化，與對照組相比向免疫刺激狀態的轉變相一致。上調的基因包括許多參與炎症的基因，如Nr4a3、H-Q5、H2-Q6、Irf3、Irf5、Acod1、Def6和Ccrl2（圖3A）。下調的基因包括Trim29、Tgfb3、Cyp1b1、Pparg和Mmp12（圖3A）。

為進一步瞭解TMAO對腫瘤浸潤性免疫細胞的轉錄影響，作者採用scRNA-seq對CD45免疫細胞進行分析。結果發現，多個免疫細胞亞群被分隔成14種具有不同轉錄譜的細胞型別（圖3C）。此外，發現免疫刺激標誌物增加，包括I型IFN反應性轉錄調節器（如NF-κB、IRF7和STAT1）、炎症細胞因子（如IL-15、IL-12、IFN-β和IL-1β）和成本刺激分子（如CD40），而免疫抑制標誌物（如AHR、VEGF和IL-10）則減少（圖3E）。另一方面，TMAO也影響了T細胞的轉錄譜，被啟用的功能包括CD8T淋巴細胞的增殖、細胞的免疫反應、抗原表達和腫瘤細胞系的細胞死亡，被抑制的功能包括調節性T淋巴細胞的數量、腫瘤細胞的增殖、纖維組織腫瘤和骨髓細胞的增殖（圖3F）。

為進一步瞭解TMAO的抗腫瘤作用是否需要TAMs和/或CD8T細胞的參與。作者在PDAC小鼠中使用抗CSF1加氯膦酸鈉耗盡巨噬細胞，發現耗盡TAMs後，與對照組相比，TMAO不再減少腫瘤負擔，這表明TAMs可能參與了TMAO的抗腫瘤作用（圖3G）。這些結果表明，TMAO透過重新配置TME中的免疫細胞，使其處於更活躍的狀態，從而抑制了腫瘤的生長。

圖3 | TMAO驅動了PDAC中TME的免疫啟用

4、TMAO介導巨噬細胞獲得免疫刺激表型

隨後，作者想確定TMAO是否對巨噬細胞的功能表型有直接影響。透過使用脂多糖或同時新增IFN-γ在有TMAO存在或者不存在的情況下，處理小鼠骨髓來源的巨噬細胞（BMDM）。結果發現，TMAO提高了促炎症細胞因子（IL-6和IL-12p40）的分泌，減少了抗炎症細胞因子IL-10的分泌。

透過RNA-seq，作者發現巨噬細胞暴露於TMAO後，超過1500個基因的表達發生了明顯的變化。被啟用的途徑包括哺乳動物雷帕黴素（mTOR）訊號、IFN訊號，以及一氧化氮和ROS的產生，被抑制的途徑包括PPAR訊號、sirtuin訊號和PTEN訊號。

為了解TMAO在腫瘤環境下對巨噬細胞的影響，作者將BMDM暴露在沒有或有TMAO的PDAC腫瘤調理介質（TCM），隨後透過RNA-seq分析發現，TMAO促使與免疫抑制（包括）、基質金屬蛋白酶（包括）和細胞外基質重塑（包括）有關的基因表達明顯下降。相反，TMAO增加了免疫刺激基因的表達（包括）。體內TMAO也明顯增加了TAMs中I型IFN途徑的調節因子（如）（圖3B和E）。總之，這些結果表明，TMAO誘導了一種免疫刺激性巨噬細胞表型，這種表型與I型IFN反應的增加有關；這種I型IFN反應的增加可能是TMAO抗腫瘤作用的一個關鍵機制。

圖4 | 透過促進I型IFN反應啟用的TMAO訊號

5、TMAO增強了I型IFN反應並以I型IFN依賴的方式發揮抗腫瘤作用

為了驗證TMAO對I型IFN的啟用效用。作者採用I型IFN的已知啟用劑如ISD、poly（dG：dC）等刺激BMDM。結果發現，ISD等啟用劑導致I型IFN反應基因的表達增加（圖4C）。TMAO誘導對ISD和poly（dG：dC）的表達（圖4C），但只誘導對poly（dG：dC）的表達（圖4C）。TMAO還增加了活化標誌物的表面表達，包括CD86、MHCII和PDL1，以及用ISD刺激後MHCIIPDL1巨噬細胞的百分比（圖4D）。這些結果表明，TMAO增強了I型IFN反應，並可能透過刺激I型IFN途徑促進獲得免疫刺激巨噬細胞表型。

6、TMAO直接改變了巨噬細胞表型以支援T細胞反應及降低PDAC負擔

為驗證TMAO刺激的巨噬細胞是否也能抑制PDAC的生長，作者採用TMAO刺激的巨噬細胞治療患有腫瘤的小鼠。結果發現，與未經處理的對照組相比，接受對照組巨噬細胞的小鼠的腫瘤負擔略有增加（圖5C）。與接受對照組巨噬細胞的小鼠相比，接受TMAO刺激的巨噬細胞的腫瘤負擔平均下降了2。4倍以上（圖5C）。接受TMAO刺激的巨噬細胞的小鼠顯示出強大的活化特徵，與接受對照巨噬細胞的小鼠相比，CD8和CD4T細胞上的IFN-γ、Ki-67、CD103和CD44明顯上調（圖5D和E）。這些結果共同表明，TMAO將巨噬細胞塑造為一種表型，增強了效應性T細胞反應，減少了PDAC生長。

圖5 | TMAO透過促進效應T細胞啟用以塑造巨噬細胞反應並降低PDAC生長

7、人類巨噬細胞彙總也發現了TMAO的促炎作用

隨後，作者在人類巨噬細胞上驗證TMAO的促炎症作用。發現，在TCM刺激的巨噬細胞培養物中加入TMAO，可顯著增加促炎症基因（包括IFNR1、IL-6、CCL-5、TNFA和IL-1B等）的表達，並顯著降低抗炎症基因IL-10的表達（圖5F）。這些結果表明，TMAO也推動了人類巨噬細胞的促炎症反應，並可能在人類中以類似於在小鼠中觀察到的方式發揮作用。

8、TMAO使PDAC對免疫檢查點治療敏感並提高PDAC小鼠生存率

由於在PDAC小鼠中施用TMAO或TMA，或在飲食中補充膽鹼，都會明顯增加PD1Tim3CD8T細胞的腫瘤浸潤（圖6A和B），這表明，將TMAO與anti-PD1或anti-Tim3結合起來，可能比單獨使用任何一種干預措施都更有效。因此，作者對此展開研究，發現單獨的anti-PD1並沒有減少腫瘤負擔；然而，與單獨的TMAO或對照組相比，anti-PD1加TMAO的組合確實明顯減少了腫瘤重量（圖6C）。與單一治療或未治療的對照組相比，聯合治療組的骨髓細胞（包括TAMs、MDSCs和CD103 DCs）的細胞表面標誌物MHCI明顯增加，這表明聯合治療增加了這些細胞群的免疫刺激表型（圖6D）。這與顯著的效應性T細胞反應有關，包括CD44Ki-67以及IFN-γTNF-αCD8和CD4T細胞百分比的明顯增加，表明T細胞的大量增殖和啟用狀態（圖6E）。此外，膽鹼代謝物TMAO或TMA與ICB（anti-PD1加anti-Tim3）相結合時，可改善PDAC對ICB的反應性和腫瘤小鼠的生存率（圖6G和H）。

圖6 | 施用TMAO或TMA增強了PDAC對ICB的反應

9、產TMA菌群丰度及CutC基因表達與PDAC患者對治療反應增強有關

最後，作者透過分析以往研究中PDAC長期生存者和短期生存者中的腸道菌群，發現，與短期生存者相比，長期生存者中Bacillus和Paenibacillus的相對丰度明顯更高（圖7A）。由於本文之前的研究表明，作者假設腫瘤對anti-PD1的臨床反應可能與含有CutC的細菌的存在或糞便微生物組中CutC基因的表達相關。透過利用他人的研究資料發現，與PD1無反應者相比，反應者中含有CutC的Bacillus的相對丰度更高（圖7B）。還發現，18個細菌菌株的anti-PD1反應和CutC表達之間的重要關聯，包括（圖7C）。這些菌株屬於兩個細菌科，即梭菌科（Clostridiaceae）和腸球菌科（Enterococcaceae），與無反應者相比，它們在反應者中含量豐富（圖7D）。此外，反應者中CutC的表達明顯增加（圖7E），而且CutC的高表達與anti-PD1後總生存率的提高明顯相關（圖7F）。

這些結果共同表明，含有CutC的細菌的存在和CutC基因的表達與癌症患者的生存率提高和對anti-PD1的反應有關。

圖7 | 含CutC細菌的丰度以及提高CutC基因表達可以促進PDAC患者生存並提高對anti-PD1反應

相關討論

腸道微生物衍生的代謝物TMAO和抗PDAC腫瘤免疫反應之間有一種未曾預見的聯絡。TMAO誘導了巨噬細胞的免疫刺激表型，增強了效應性T細胞的功能，並使PDAC對ICB有反應。在臨床上，含有CutC的細菌與anti-PD1的反應改善有關。

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TMAO可以說是近年來比較熱的小分子代謝物，大多研究均與其促炎的作用有關，比如TMAO與動脈粥樣硬化等。本研究創造性地將TMAO與PDAC腫瘤聯絡起來，採用多組學聯合的手段，如

非靶代謝組學、轉錄組學及單細胞轉錄組學

，發現TMAO可以透過促炎的作用發揮抗腫瘤功能，並深入探討了TMAO抗腫瘤的機制。這一發現為深入理解腫瘤治療機制，腫瘤與炎症的關係，以及TMAO與腫瘤免疫的關係提供了新的思路和見解。

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（非靶代謝組學、轉錄組學（RNA-seq）及單細胞轉錄組學（scRNA-seq）、熒光流式）

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