河大李軼揭示潮灘水產養殖汙染對沉積物ARGs和群落構建機制的影響

凌恩生物合作合作河海大學李軼課題組於《Science of the Total Environment》期刊發表“Tidal flat aquaculture pollution governs sedimentary antibiotic resistance gene profiles but not bacterial community based on metagenomic data”研究文章，揭示了環境引數對ARGs的影響，並確定了江蘇鹽城兩個地區潮灘水產養殖沉積物中決定抗菌素耐藥性的生態過程的影響。

期刊：

Science of the Total Environment

影響因子：

10。753

發表時間：

2022

樣本型別：

水體、沉積物

客戶單位：

河海大學

一、研究背景

沿海潮汐灘是陸地和海洋環境的交叉區域，被認為是人為活動（例如漁業和水產養殖）汙染物的儲存庫。具體來說，沿海水產養殖環境中抗生素和抗生素抗性性基因（ARGs）的流行對河口生態系統構成了嚴重威脅。然而，在潮灘區，水產養殖對ARGs和群落的發生和豐富程度的貢獻尚未得到充分的探索。

二、實驗設計

本研究是在中國江蘇省鹽城市的沿海潮灘水產養殖區進行。從射陽潮灘水產養殖區（序號：SY1-SY7）和東臺潮灘水產養殖區（序號：DT1-DT7和RE；32°55′-33°84′N，120°95′-120°42′E）中共選擇15個取樣點（圖1）。分別在各個取樣點採集水體和沉積物樣本，進行理化性質的測定，以及沉積物中的抗生素含量的測定。

利用宏基因組測序方法研究了江蘇潮灘水產養殖區中ARGs的丰度及其與細菌群落和環境引數之間的關係。

圖1研究區域和取樣點分佈

三、實驗結果

1、潮灘水產養殖區ARGs的分佈

對水體和沉積物樣本理化引數測定結果表明，射陽縣SY1-SY7取樣點的理化引數低於東臺市DT1-DT7取樣點（P≤0。05）。這些結果符合實際的水產養殖環境。

所有沉積物樣品的抗生素濃度測定範圍從未檢測到（nd）到35。50 ng/g dw。9種目標抗生素中有8種在水產養殖沉積物樣本中被鑑定出來（圖2）。RE取樣點的氧氟沙星（OFX）和磺胺嘧啶（SDZ）抗生素濃度及其其他引數（如TN、TP）均超過了其他取樣點的相應值。因此，選擇RE位點作為參考樣本進行進一步分析。

圖2水產養殖潮灘沉積物中的抗生素殘留物

作者使用宏基因組和CARD資料庫分析了潮灘水產養殖區的ARG丰度和抗生素耐藥型別。總共有247個ARG亞型與33個ARGs型別相關。最突出的ARG型別是賦予肽類、糖肽、β-內醯胺、異煙肼、氨基糖苷類、利福黴素、莫匹羅星、梭鏈孢酸鈉和氟喹諾酮類藥物抗性的基因（圖3（a））。其中大多數與人類和動物常用的抗生素有關。

最豐富的ARGs被確定為macB、tetA（48）、evgS、walK、bcrA、fusA、pvrR和rpoC（從最多到最少）。這些基因貢獻了約60%的總ARG丰度，約30%的基因以100%的檢測頻率普遍存在。

與射陽潮灘樣品相比，東臺潮灘區的總ARG丰度也表現出更高的水平（P < 0。05）。基於Bray-Curtis方法的PCoA結果表明，地理區域是抗生素耐藥型別的主要解釋變數（解釋51。2%的方差）（圖3（c））。

圖3水產養殖潮灘帶沉積物中ARGs的特性研究

2、細菌群落與ARGs之間的關聯

宏基因組測序結果表明，在所有沉積物樣品中，變形菌門（66。26%）為優勢門，其次是放線菌門（15。35%）、黃桿菌門（3。25%）等（圖4（a））。RE取樣點的優勢細菌門與其他取樣點不同，例如擬桿菌門的相對丰度最高。

在兩個研究區域的門水平上，PCoA分析表明細菌組成存在顯著差異（圖4（b））。這些結果與所有樣品的ARG丰度特徵一致（圖3（c））。RDA分析結果表明，抗生素、鹽度和TOC作為環境影響因素與RE、DT2和ST1樣品中的細菌群落和豐度有關。而SY2、SY4、SY5、DT3、DT6與TOC呈正相關，與pH呈負相關。此外，TN與潮灘水產養殖區細菌群落的相關性較弱（圖4（c））。

圖4水產養殖潮灘沉積物細菌群落和多樣性特徵

透過網路分析確定了細菌群落（前50個屬）和ARGs關聯網路圖，從而分析ARGs潛在的細菌宿主。東臺潮灘養殖基地（圖5（a））的網路分析結果得到79個節點和320條邊，射陽場地有81個節點和321條邊（圖5（b））。東臺地區和射陽地區的網路模組化指數分別為0。631和0。551，表明這些網路具有較強的模組化結構。

Paraburkholderia、寡養單胞菌屬、假單胞菌、Draconibacterium、中慢生根瘤菌屬與ARG型別呈顯著相關性（圖5（a））。其中，Paraburkholderia、寡養單胞菌屬、假單胞菌是 Fucidin（如vanH、vanS）、磷黴素（如GlpT、PtsI）、肽類（如mprF、liaS）和利福黴素（如rpoB）抗性基因的細菌宿主。中慢生根瘤菌屬被確定為該區域抗生素外排泵的細菌宿主，揭示了其在環境中潛在水平基因轉移的能力。

圖5基於（a）射陽和（b）東臺養殖潮灘，細菌OTUs與ARG類的共發生網路圖

3、攜帶ARGs的致病菌

本研究在屬和種水平上，對所有沉積物樣品分別獲得了1939個屬和7923個種。1939個細菌屬大多屬於變形菌門。基於CARD細菌病原體資料庫，所有樣本共鑑定出21種高於90%相似性的潛在病原體。鑑定出10株最豐富的病原菌，與臨床相關抗菌素耐藥性相關。

macB（大環內酯類抗性基因）和tetA（四環素抗性基因）被確定為最豐富的ARGs，分別與本研究中的淋病奈瑟菌和嗜麥芽窄食單胞菌相關。

4、ARG群落生態構建過程

本研究採用中性模型來定量理解隨機過程在確定ARG群落和細菌群落組裝模式中的重要性。中性模型成功地擬合了細菌類群的發生頻率和類群相對丰度的變異性之間的大部分關聯，解釋了91。7%的群落方差（圖6）。這表明，隨機過程在細菌群落構建中的貢獻很大。

與細菌群落相比，對於ARG群落，中性模型不能擬合ARG的發生頻率。這說明隨機過程在ARG群落構建中並沒有起主導作用（圖6（b））。基於零模型分析結果顯示，異質性環境選擇（75。00%）構成了潮灘水養殖環境中ARG群落聚集的生態機制基礎。這表明，確定性過程有助於形成本研究中ARGs的群落構建。

圖6細菌群落和ARG群落的生態過程

四、研究結論

綜上所述，本研究利用宏基因組組裝分析，研究了沿海生態系統中ARGs及其相關細菌群落生態過程的分佈。研究結果揭示了環境引數對ARGs的影響，並確定了江蘇鹽城兩個地區潮灘水產養殖沉積物中決定抗菌素耐藥性的生態過程的影響。主要結論如下：

1

沉積物樣品中抗生素濃度為nd～35。50 ng/g dw，東臺潮灘抗生素汙染較射陽潮灘嚴重。

2

宏基因組結果表明，在所有樣本中，共有247個與ARG 33個型別相關的ARG亞型被表徵，其在東臺地區的丰度超過射陽地區。

3

同時，潮灘水產養殖中的21種細菌被鑑定為攜帶ARG的病原體，包括大腸桿菌、河流弧菌和金黃色葡萄球菌。

4

採用中性和零模型分析確定群落生態過程，結果顯示細菌群落和ARG群落一般分別以隨機過程和確定性過程為主。

參考文獻

Tidal flat aquaculture pollution governs sedimentary antibiotic resistance gene profiles but not bacterial community based on metagenomic data。 Science of the Total Environment， 2022。