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成功進行ChIP染色質免疫共沉澱實驗的7個技術方法技巧
- 由 輝駿生物fitgene 發表于 垂釣
- 2022-10-28
怎麼泡蛋白質粉不會有沉澱
您是ChIP新手或是想改進實驗結果？輝駿生物在下文介紹的7點的技術提示，將幫助您實現成功的染色質免疫共沉澱ChIP實驗！
染色質免疫沉澱 （ChIP） 概述
ChIP 是一種允許分析蛋白質與活細胞中染色質的相互作用（轉錄因子）的技術。
ChIP 提供有關染色質結構和與處於不同功能狀態的基因結合的因子的資訊。
ChIP 方法涉及蛋白質-DNA 交聯。
對分離的粗染色質進行超聲處理以產生小片段，通常平均大小為 300-1000 bp。
蛋白質特異性抗體用於免疫沉澱（下拉）染色質片段。
結合感興趣蛋白質的 DNA 區域
體內
。
鑑於越來越多的證據表明染色質結構在調節基因表達中起決定性作用，ChIP 允許同時研究基因調控的結構和功能方面。 以下是輝駿生物相關的提示摘要，可幫助您最佳化 ChIP 實驗。
ChIP 工作流程總結：
1。 細胞/組織分離
2。 DNA-蛋白質交聯在其染色質結合位點穩定靶蛋白
此時可以停止 ChIP 協議並在 -80°C 下儲存
3。 細胞裂解提供進入染色質的途徑
4。 染色質碎裂（超聲）
此時可以停止 ChIP 協議並在 -80°C 下儲存
5。 免疫沉澱 （IP）/使用特異性抗體下拉染色質片段
6。 反向交聯從 DNA 片段中分離抗體靶向蛋白
7。 DNA片段的純化和淨化
8。 DNA 分析：PCR、qPCR、微陣列、測序
成功進行 ChIP 實驗的提示-輝駿生物
1：始終將細胞/組織置於冰上
溫度很關鍵。 在 4°C 下進行細胞裂解。
保持樣品冰冷並使用冰冷緩衝液。
2：交聯不足/過度交聯
交聯時間和甲醛濃度都很重要。
請注意：使用多聚甲醛時，請確保它是新鮮製備的（最終濃度為 1%–1。5%）。
交聯的持續時間是關鍵，可能導致交聯不足或過度交聯
3：染色質剪下和超聲處理
避免組織懸浮液中有大碎片。
使用切割的移液器尖端確保組織的精細均質化。
確保超聲儀探頭
不
與管壁接觸。
增加超聲處理步驟的數量以獲得更好的染色質剪下； 但是，避免增加每個步驟的時間（或功率），因為這可能會使樣品過熱並導致抗原性喪失。
在超聲波儀中加入冰以避免樣品過熱。
最好不要將染色質超聲處理到小於 500 bp 的片段大小（進行瓊脂糖凝膠電泳以確定染色質大小）。
請注意：不同的細胞型別可能有不同的最佳 DNA 片段化。 最佳化超聲時間和振幅以獲得最佳的 DNA 片段化。
準備用於 ChIP 中染色質定量分析的輸入樣品
輝駿生物：ChIP染色質免疫共沉澱流程圖
4：免疫沉澱（IP）
IP 分數代表稀釋和預清除 ChIP 的分數。 它用於
涉及
目標抗體或對照抗體的免疫沉澱步驟。
每個 IP 反應使用大約 25ug DNA
每 25ug DNA 使用 1-10ug 抗體
一些抗體可能允許與裂解物在室溫下進行短時間孵育； 然而，一般來說，在 4°C 下孵育過夜會增加訊號和特異性。
準備珠子； 如果使用蛋白 A 和蛋白 G 珠，混合等體積
在 RIPA 緩衝液中多次洗滌珠子混合物
阻止珠子以防止非特異性結合
將磁珠新增到樣品中進行 IP 反應，並在 4°C 下孵育過夜
為每個 ChIP 實驗準備陽性和陰性對照
使用已知（陽性）和未知（陰性）基因組區域的反應作為實驗對照
5：反向交聯
通常，在 95 °C 下孵育 15 分鐘就足以誘導反向交聯（破壞蛋白質-DNA 複合物）。
一些樣品需要在 65 °C 下進行長達 16 小時的蛋白酶 K 處理，這有助於肽裂解。
6：DNA洗脫純化
> 使用不同的洗滌緩衝液（低鹽和高鹽、LiCl 和 TE 緩衝液）。
>
使用商業純化柱時，在洗滌步驟後檢查柱是否完全乾燥，因為任何殘留的水分都會抑制洗脫。
>
確保將洗脫緩衝液直接放在矽膠膜上並使其吸附至少一分鐘。
>
從庫存中準備新的解決方案以避免汙染。
>
樣品中顯示的微弱 PCR 訊號或沒有 DNA 擴增可能是由於 PCR 擴增區域跨越無核小體區域的引物結果不足。
>
請注意：使用不同的引物條件和稀釋度測試基因組 DNA 的引物對。 標準/輸入 DNA 的使用將決定引物的功效。
>
確保 PCR 反應中有足夠的 DNA，並且您的 PCR 條件是最佳的。 如果需要，可以在 PCR 反應中新增更多 DNA 或增加擴增迴圈數。
>
為避免重複之間的差異，請為所有樣品新增相同數量的蛋白質 G/A-瓊脂糖或磁珠。 確保珠子在移液時懸浮良好。
>
雖然陽性對照中沒有產物，但請確保 IP 反應中有足夠的染色質或抗體。
>
確保最佳化 IP 孵育時間。
>
完成蛋白質 G/A 珠子中染色質的洗脫。 最佳洗脫溫度為 65℃，並經常混合以保持珠子懸浮在溶液中（約 10 分鐘）。