第一鏈cDNA會作為模板，透過基因特異性引物和接頭引物得以擴增

RLM-RACE操作簡述如下。1。 Poly（A）t RNA製備產物首先使用小牛腸磷酸酶去除汙染rRNA、tRNA和RNA片段5‘端磷酸殘基。脫磷酸化的RNA在後續RNA連線酶作用下不能進行連線反應。

2。用酚-氯仿抽提法去除磷酸酶，RNA 產物再用菸草酸焦磷酸酶處理，其目的是水解帽子結構區三磷酸鍵橋上的磷酸酐鍵並暴露出一個5’端磷酸殘基。這樣脫帽後的mRNA就變成噬菌體T4編碼的RNA連線酶的底物。

3。因為化學合成的寡聚核苷酸在5‘端含有一個5’羥基，可使用T4編碼的RNA連線酶把寡聚核苷酸（通常為30~40 個核苷酸）連線到mRNA脫帽後暴露出來的5‘磷酸基團上，連線上的寡聚核苷酸可作為下一步PCR的接頭。

4。 寡聚核苷酸-RNA嵌合體作為模板合成第一鏈cDNA， 引物可以使用隨機八聚體或十聚體引物。

5。延伸至嵌合RNA5’端的第一鏈cDNA會攜帶一個和它3‘端寡核苷酸互補的序列。在熱啟動PCR中，第一鏈cDNA會作為模板，透過基因特異性引物和接頭引物得以擴增。只有在其5’端含有接頭序列的cDNA才能被擴增。

6。透過樹脂吸附和洗脫方法純化擴增產物（如Promega公司的WizardPCR試劑盒），而後克隆入質粒載體。

SMARTer RACE Clontech公司的SMARTer RACE試劑盒避免了接頭連線反應，雖然不是很有效，但是在RACRPCR中是直接使用第一鏈cDNA進行PCR。步驟簡述如下。

1。第一鏈cDNA是透過改良的鎖-塢oligo （dT）引物來啟動的，在其3‘端有兩個降解的核苷酸。