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基因功能研究的那些套路你知道多少?(中)

  • 由 伯遠生物 發表于 棋牌
  • 2021-12-04
簡介圖8 MIR167a和MIR167b啟動子活性分析(O-Y)今天的乾貨就分享到這裡啦,下面做一個簡單的總結,這一期伯小遠主要介紹了研究一個基因的功能,一般會先進行生物資訊學分析,然後對基因的功能進行預測,做亞細胞定位分析,最後利用轉基因技術

mirna如何抑制翻譯

時隔一期,伯小遠帶著基因功能研究的乾貨又和大家見面啦!咱們話不多說,直入主題吧!

在上一期的文章中,伯小遠對基因的結構進行了分析,在對基因的結構有所瞭解之後,咱們再來討論基因的功能如何研究會更容易理解哦!

基因功能的研究策略主要包括:

1、應用生物資訊學分析軟體或資料庫進行結構和功能的預測;

2、基因的體內表達規律分析;

3、亞細胞定位分析;

4、轉基因研究;

5、基因編碼產物相互作用蛋白的研究

1、應用生物資訊學分析軟體或資料庫進行結構和功能的預測

在對基因功能進行實驗學驗證之前,研究者可先對基因功能進行合理預測,再根據預測的結果,進而制定出適合的實驗室研究方案,從而避免研究的盲目性,節約研究成本。那該怎麼預測呢?

生物資訊學(Bioinformatics)是在生命科學的研究中,以計算機為工具對生物資訊進行儲存、檢索和分析的科學。它是當今生命科學和自然科學的重大前沿領域之一,同時也將是21世紀自然科學的核心領域之一。其研究重點主要體現在基因組學(Genomics)和蛋白質組學(Proteomics)兩方面,具體說就是從核酸和蛋白質序列出發,分析序列中表達的結構功能的生物資訊。

目前,生物資訊學分析已成為新基因功能研究首選和必用方法,其具有方便快捷和經濟等優點。研究者往往可以從中得到與新基因功能有關的重要資訊,初步推測基因的可能功能,進而制定出進一步的實驗室研究方案。

研究者在最開始時往往會獲得基因序列資訊,可首先進行序列同源性分析,包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析,這是目前生物資訊學技術中應用最為廣泛的基本技術之一。序列同源性分析主要採用序列分析比較工具,如BLASTn和BLASTx,將一段結構和功能未知的新DNA片段與GenBank資料庫中結構或功能已知的序列進行比對,根據這些已知基因的功能資訊來初步推測新基因的功能,從而建立基因序列結構和功能的關係。

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圖1 生物資訊學應用於蛋白質相互作用

2、基因的體內表達規律分析

基因表達的時空性是指基因的表達在個體發育的不同階段以及在個體的不同組織和細胞型別中均不相同,是有機體發育、分化、衰老等生命現象的分子基礎。

基因表達的時空性特徵為基因功能的研究提供了重要的資訊:如果基因在某一特定的正常組織細胞中的表達水平較高,則往往表示其在維持正常生理狀態中發揮著重要的作用;而如果基因在相應的突變體中表達異常,則提示其可能與該突變過程的發生、發展有關。因此,在研究一個基因的功能前,首先要在mRNA和蛋白質兩個水平上對基因的時空表達譜進行分析,即看其在各種不同的正常或突變體中是否表達以及表達水平的高低等,從而摸清基因在體內的表達規律。

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圖2 利用強啟動子過表達單個TFs LEAFY COTYLEDON2 [LEC2] 和 AtMYB23分別促使胚和毛狀體異位形成

mRNA水平的表達譜分析

在mRNA水平上進行的基因表達譜分析實際上就是進行轉錄組研究。細胞的轉錄表達水平能精確而特異地反映其型別、發育階段以及反應狀態。

經典的mRNA水平的表達譜分析方法有Northern Blotting、原位雜交及RT-PCR等。Northern Blotting是一種在mRNA水平上對基因表達進行分析的經典技術,它可以特異性的定量檢測基因的表達水平,還能檢測出基因轉錄本的大小與型別。但是,Northern Blotting的檢測效率和靈敏度不高,無法檢測出較低的基因表達量,而且操作過程也較為繁瑣,還帶有放射性物質。這將造成環境汙染,危害人類健康。

原位雜交技術不僅可以檢測mRNA在特定生物體或組織、細胞中的具體表達位置,並能對待測核酸分子進行定性、定量及定位分析,因此被各實驗室廣泛採用。

RT-PCR主要包括半定量RT-PCR、實時定量RT-PCR和競爭性定量RT-PCR。半定量RT-PCR操作簡便,經濟快捷,但精確度不高,無法進行絕對定量,因此多用於基因表達水平的快速初步分析;實時定量RT-PCR特異性更強,有效地解決了PCR汙染的問題,且自動化程度高,因此被廣泛應用,不足之處是其成本相對較高;競爭性RT-PCR則是將特異性目的序列與已知濃度的內標RNA同時進行擴增,透過比較目的模板所產生的訊號和內標產生的訊號,從而確定目的模板的相對水平。

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圖3 在高磷和低磷條件下,GmSPX基因在不同部位的表達水平

蛋白質水平的表達譜分析

很多研究指出,細胞內特定基因的mRNA水平變化和蛋白質水平變化的一致性很差,即便知道了全部基因的表達情況,也不能反映基因功能的體現者和行使者——蛋白質的實際合成情況,因此難以闡明基因的實際功能。因此基因組計劃開始轉向了蛋白質終產物的表達情況研究。這種在蛋白質水平上的表達分析最常用的技術是Western Blotting和免疫組化。

Western Blotting與前述的Nortern Blotting類似,不僅可以進行定量分析,而且還可以檢測蛋白質的分子量大小及聚體形式。免疫組化技術則能夠準確地檢測蛋白質在特定生物體或組織、細胞中的具體表達位置,是研究蛋白質定位、定量的重要方法,並且特異性強,靈敏度高。

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圖4 VRN2-FLAG、FIE-HA、VIN3-HA蛋白表達隨時間變化

3、亞細胞定位分析

一般情況下我們在對基因的功能進行預測之後,對於該基因的亞細胞定位也會做一個預測,由於亞細胞定位能較快拿到實驗結果,所以會首先做一個亞細胞定位分析,根據實驗結果,一方面可以驗證預測是否正確,另一方面可以幫助我們分析其可能的功能。瞭解蛋白的亞細胞定位對於研究基因的功能、蛋白互作及其作用機理是必要的。

目前比較常用的就是將目標基因與熒光蛋白的N端或者C端融合,透過瞬時轉化技術使該融合蛋白在受體材料細胞內表達,透過觀察熒光蛋白在細胞內顯示的位置確定目標蛋白的位置,從而確定目標蛋白的亞細胞定位情況。

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圖4 GmVTL1a在菸草原生質體中的亞細胞定位。

4、轉基因研究

生物資訊學分析在對基因功能進行合理的預測後,又做了亞細胞定位分析,但是這些僅僅只能對基因的功能有一個大致推斷,在一定程度上需透過試驗方法進行驗證,並進一步外延生物資訊學研究的結果。驗證方法一般都會用到轉基因技術,基因功能研究至少可以包括以下幾種型別轉基因與基因敲除材料的構建:

(1)增強基因表達:過表達

過表達通常是融合目的基因的全長序列與表達水平較高的啟動子(如:CaMV35S、pUBQ10等),透過遺傳轉化,獲得該基因表達上調,表達產物大量積累的個體。

有時,想要研究的基因可能屬於某個基因家族,在基因組中有多個結構同源,功能類似的複製,冗餘性比較高,敲除其中一兩個基因後,其它家族成員可以代替其功能,所以敲除個體沒有任何表型或缺陷,很難研究基因的功能。這時候,我們可以嘗試對該基因進行過表達,增加此基因表達產物的丰度,以期增強其在生理生化過程中的作用,並透過比較過表達材料與野生型植株在表型上的一系列差異來研究該基因的功能。

同時,過表達材料也可以和基因敲除,敲低的突變體材料之間相互比較,互相印證。

(2)恢復基因表達:功能互補

由於EMS誘變,輻射誘變或T-DNA插入構建突變體時,往往突變位點不唯一,有大量的背景突變。對於正向遺傳學篩選到的突變體,我們進行基因定位與克隆,發現是某個基因突變導致的表型改變。怎麼驗證該基因就是造成表型改變的基因,而不是錯誤定位到了不影響表型的背景突變表型基因呢?

很簡單,透過基因回補。如果克隆到的基因發生了隱性突變,那麼表型可能就是突變導致該基因功能喪失或減弱造成的,將該基因的編碼區連同表達調控區域(包括啟動子、UTR等)透過轉基因回補到突變體,表型就能隨著該基因正常版本的出現而恢復到野生型水平。如果回補株系出現了預期的表型恢復,那麼就說明定位到的基因確實是造成表型改變的基因。

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圖5 在突變體中恢復PTOX基因使得表型恢復

這裡還有一些問題,比如,顯性突變或者功能獲得性突變(Gain of function)的突變體,以及顯性負性突變體(Dominant negative)往往不能透過轉入正常版本使之表型恢復到野生型水平。這個時候可以試著把突變體版本轉入野生型,看轉入突變基因的野生型植株會不會出現類似於突變體的表型,進而驗證表型改變是不是該基因突變造成的。

(3)敲除基因:CRISPR

研究植物基因功能的重要前提之一是獲得突變體。比如,當A基因突變失去功能了,植株變矮,那麼A基因就可能作用於植物長高;當B基因突變失去功能,植株的抗病能力下降,那麼B基因就可能作用於植物抗病。

透過T-DNA插入突變、轉座子插入突變、基於基因編輯技術的敲除等,是獲得基因敲除突變體的主要手段,抑制目的基因的表達則是獲得基因敲低突變體的有效途徑。

目前,擬南芥、玉米、矮牽牛中已有大量可用的突變群體,水稻的插入突變群體也正在逐漸擴充完善。以T-DNA、轉座子及質粒介導的插入突變等構建突變體庫,是利用插入突變進行功能基因組學研究的主要方法。T-DNA插入突變對於正向遺傳學和反向遺傳學的研究極其方便。農桿菌介導的T-DNA插入突變適用於多種植物,不僅插入位點的隨機性比較強,且能直接在植物基因組DNA中產生穩定的插入突變。此方法的缺點是隻適合易被T-DNA轉化的植物,T-DNA邊界的質粒序列可隨著T-DNA整合到基因組並出現由於整合引起的染色體重排,有可能造成突變體表型與T-DNA插入無關。

目前,基於CRISPR/Cas的基因編輯工具因其簡單高效的特徵,被廣泛應用於各種突變體創制。編輯啟動子區域,不僅能改變基因表達量,還有可能改變基因表達模式,而編輯基因的編碼區,則可以實現鹼基替換、插入、缺失等突變……

有時候,由於個別基因發揮極其重要的功能,或者它們在植物基因組中冗餘性低,沒有功能類似的基因代替它們,其功能喪失的純合突變往往會致死。對於這種基因,有的雜合子也會表現出異於野生型的表型,我們可以用雜合子研究其基因功能,有時候雜合子並不表現出任何不同,但是純合又致死,我們可以透過RNA干擾和反義技術降低其表達量,獲得基因敲低突變體。

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圖6 敲除GmVTL1基因導致根瘤發育缺陷

(4)反義技術

反義技術是指透過鹼基互補配對原理,利用人工或生物合成的特異互補性DNA或RNA片段(或其修飾產物),干擾基因的解旋、複製、轉錄、mRNA剪接加工與輸出、翻譯等各個環節,抑制或封閉靶基因的表達,從而調節細胞的生長分化等。反義技術主要包括反義寡核苷酸技術(Antisense oligonucleotides, ASON)、核酶技術(Ribozyme)和小干擾RNA。

(5)RNAi

所有生物體體內都有一套限制異常或外源性基因表達的保護機制。例如,在將基因轉入植物後,轉入基因會出現自身沉默,並同時透過轉錄後基因沉默機制,引起同源內源基因的沉默。轉錄後基因沉默並非偶然事件,而是生物體在長期的進化過程中,為了防止外源物的引入對宿主細胞內平衡機制的致命破壞,而形成的一種防禦系統。

研究者們也發現,當在多種生物體內轉入雙鏈RNA(Double stranded RNA, dsRNA)分子後,會引起強烈的特異性同源基因沉默,且其誘導沉默的效果比正義或反義RNA更為明顯,最終產生功能缺失表型。這一現象引起了研究者的廣泛關注,人們將這種外源性或內源性雙鏈RNA匯入細胞後所引起的轉錄後基因沉默機制稱為RNA干擾(RNA interference, RNAi)。

其中小干擾RNA(Small interfering RNA, siRNA)是一類重要的、可引起RNAi的外源性雙鏈RNA分子,它們能夠與核酸酶和螺旋酶等結合在一起形成RNA誘導沉默複合物(RISC),並精確引導RISC中的核酸酶降解特異性的mRNA,從而關閉基因的表達,使細胞抵抗外來基因侵入及病毒感染。RNAi現象首先在線蟲體內得以發現,隨後在多種生物,如果蠅、擬南芥、小鼠及哺乳動物等的成體細胞中均有發現,這表明RNAi是生物界普遍存在的RNA水平上調節基因表達的方式。

RNAi技術是透過人為地引入與靶基因具有同源序列的dsRNA,誘導靶基因的mRNA降解,從而達到阻止基因表達、產生“功能失活”的目的。在RNAi試驗中,首先需要構建雙鏈RNA表達載體,然後將這種載體匯入到受體細胞後,表達產生的雙鏈RNA在Dicer酶作用下形成siRNA,從而引起具有相同序列的mRNA發生降解,導致細胞或個體不能合成相應的蛋白質,所以個體會表現出功能缺失表型。

miRNA是一類長約18~25個核苷酸的、內源性非編碼性的單鏈小分子RNA,可與靶基因mRNA的3’UTR完全或不完全互補結合,從而降解靶基因mRNA或抑制mRNA的翻譯,最終在轉錄水平和轉錄後水平上調控靶基因的表達。miRNA在不同物種間具有高度的保守性,表達具有細胞或組織特異性,而且具有很強的基因沉默功能,能夠介導RNAi現象。miRNA與siRNA之間存在著很多相似之處,兩者長度都約在22個核苷酸左右,都是由雙鏈RNA或RNA前體加工形成的,都依賴於Dicer酶,並且都是RISC的組成部分。兩者的不同之處在於:

①來源不同:miRNA是生物體的固有因素,是內源性的,而siRNA是人工體外合成後透過轉染進入體內的,是RNAi的中間產物;

②結構不同:miRNA為單鏈RNA,而siRNA是雙鏈RNA;

③Dicer酶對兩者的加工過程不同,miRNA是由不對稱加工形成的,僅是剪下前體miRNA的一個側臂,其它部分降解,而siRNA對稱地來源於雙鏈RNA前體的兩個側臂;

④作用部位不同:miRNA主要作用於靶基因mRNA的3’UTR區域,而siRNA可作用於靶基因mRNA的任何部位;

⑤作用方式不同,miRNA既可抑制靶基因mRNA的翻譯,也可以導致靶基因mRNA降解,即在轉錄後水平和翻譯水平起作用,而siRNA只能導致靶基因mRNA的降解,為轉錄後水平調控;

⑥miRNA主要參與內源基因的調節和細胞發育過程,而siRNA的原始作用是抑制轉座子活性和病毒感染。

儘管miRNA為內源性RNA分子,但是研究者們目前開發出了多種miRNA的模擬物,促進了miRNA在基因功能研究中的應用。

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圖7 miRNA的生物發生

(7)啟動子分析

對於基因表達模式的分析,一般採用報告基因分析法。基因的時空表達依賴於反式作用因子識別啟動子上的瞬時元件,招募轉錄調控蛋白,決定目的基因的轉錄、翻譯。因此,我們可以用目的基因的啟動子驅動報告基因表達,將這一構建轉入植物,實現目的基因時空表達模式的視覺化。常用的報告基因可以編碼一個易於離體檢查的酶,或者能活體條件下進行組織化學定位。常見的報告基因有LUC(螢火蟲熒光素酶基因),GUS(β-葡糖醛酸糖基轉移酶),lacZ(β-半乳糖苷酶基因),GFP(綠色熒光蛋白)等。

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圖8 MIR167a和MIR167b啟動子活性分析(O-Y)

今天的乾貨就分享到這裡啦,下面做一個簡單的總結,這一期伯小遠主要介紹了研究一個基因的功能,一般會先進行生物資訊學分析,然後對基因的功能進行預測,做亞細胞定位分析,最後利用轉基因技術實驗對基因功能進行驗證研究,下期咱們會分享基因編碼產物相互作用蛋白的研究,想知後續如何,請關注伯遠生物公眾號,伯小遠和您不見不散!希望有了伯小遠的陪伴,您的科研之路越走越順!

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